灰樹花多糖協(xié)同順鉑對HeLa細胞凋亡的影響

解嘉志 王文碩 許巖松 邱 原 金海萍 呂冬霞

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

灰樹花多糖協(xié)同順鉑對HeLa細胞凋亡的影響

解嘉志 王文碩 許巖松 邱 原 金海萍 呂冬霞

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討灰樹花多糖(PGF)協(xié)同順鉑(DDP)對HeLa細胞凋亡的作用。方法 流式細胞儀測定不同藥物處理組的凋亡率,蘇木素-伊紅(HE)染色觀察凋亡細胞形態(tài),免疫組化法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3 蛋白表達。結果 流式細胞儀檢測顯示：PGF(0.05 mg/L)、DDP(1 mg/L)及聯(lián)合組(PGF 0.05 mg/L+ DDP 1 mg/L)作用24 h凋亡率分別為21.28%、23.60%和42.13%，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)，協(xié)同作用組與各單藥組比較差異顯著(P<0.05)；HE染色觀察到凋亡細胞形態(tài)學改變；免疫組化顯示，聯(lián)合用藥組與兩單藥組比較caspase-3 蛋白表達上調。結論 聯(lián)合用藥對HeLa細胞的凋亡率較單獨用藥組有明顯提高，其作用機制可能與caspase-3蛋白表達上調有關。

灰樹花多糖；順鉑；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

化療藥物在惡性腫瘤的治療中起到非常重要的作用，但毒副作用也較大。研究表明，灰樹花多糖(PGF)具有改善免疫系統(tǒng)功能、抑制腫瘤、調節(jié)血糖等功能〔1〕。本研究選用PGF聯(lián)合順鉑(DDP)，研究其對HeLa細胞凋亡的影響，探討PGF對DDP的增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料 小牛血清與RPMI1640培養(yǎng)液(杭州四季青),DDP(山東齊魯制藥)，PGF(浙江方格藥業(yè)公司)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3 免疫組化試劑盒(天津索羅門生物公司)。超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，流氏細胞儀(美國BD公司)。HeLa細胞(武漢大學典型培養(yǎng)物冷藏中心)。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 使用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含10%小牛血清)培養(yǎng)細胞。常規(guī)方法傳代。前期研究顯示0.05 mg/L PGF與1 mg/L DDP聯(lián)合作用于24 h時點具有協(xié)同作用。分組：空白對照組：予含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；PGF組：PGF濃度為0.05 mg/L；DDP組：DDP濃度1 mg/L;0.05 mg/L PGF與1 mg/L DDP為聯(lián)合用藥組。

1.3 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察凋亡細胞 多聚賴氨酸處理蓋玻片，將其置于6孔板中，以1×105個/ml接種，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入藥液，于24 h進行常規(guī)HE染色，在顯微成像系統(tǒng)下觀察結果。

1.4 流式細胞儀測定凋亡率 取對數(shù)生長期細胞加入藥物，培養(yǎng)24 h后，采用磷脂結合蛋白Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。用無乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化、離心并收集細胞；冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次；400 μl的Binding Buffer懸浮細胞；加5 μl Annexin V-FITC于懸液中，2℃～8℃避光15 min后，再加Propidium Iodide 5 μl，混勻繼續(xù)避光孵育5 min；1 h內進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.5 鏈霉親合素-生物素復合物(SABC)免疫組化法檢測caspase-3 蛋白表達 根據(jù)說明書檢測caspase-3 蛋白表達。隨機選取不重復的10個高倍視野(×400)觀察 。鏡下caspase-3表達陽性細胞為細胞膜和細胞質呈褐色或棕黃色，計算陽性細胞數(shù)量，并求平均值。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS11.5 軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 HE染色觀察凋亡細胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察染色細胞，與對照組比較，處理組呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)：胞體小，皺而圓，核深染，質濃縮。

2.2 流氏細胞儀測定凋亡率 PGF組、DDP組及聯(lián)合用藥組凋亡率分別為21.28%、23.60%和42.13%，與對照組(1.18%)比較均有顯著差異(P<0.05)；聯(lián)合用藥組與各單藥組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3 免疫組化法檢測caspase-3 蛋白表達 聯(lián)合用藥組(49.94%±3.73%)與兩單藥組(DDP組：35.23%±3.69%；PGF組：33.61%±3.35%)比較caspase-3 蛋白表達上調(P<0.05,P<0.01)，且均高于空白對照組(10.11%±1.67%，P<0.05)。

3 討 論

本實驗通過HE染色觀察到典型的凋亡細胞。流式細胞儀檢測結果提示PGF與DDP有協(xié)同作用，使HeLa 細胞對DDP的敏感性提高。研究提示，PGF聯(lián)合DDP可明顯增強抗腫瘤作用，對其作用機制的研究為臨床PGF與DDP聯(lián)用并作為化療增敏劑治療宮頸癌提供了新思路、新方法。

目前研究普遍顯示，抗腫瘤藥物大多數(shù)以誘導腫瘤細胞凋亡的形式殺死腫瘤細胞進而達到治療目的〔2,3〕。引起細胞凋亡的因素很多，其中細胞凋亡是由一系列高度調控的caspase級聯(lián)反應導致的結果已被普遍接受，認為細胞凋亡的核心執(zhí)行者是caspase〔4,5〕。caspase家族中caspase-3是效應caspase〔6〕。細胞間的信號傳遞被caspase-3通過下游效應因子切斷，并關閉DNA的復制與修復，破壞DNA的結構和細胞核，誘導凋亡小體的形成，進而執(zhí)行凋亡功能〔7〕。

PGF、DDP單獨應用可導致細胞中caspase-3表達增強，且協(xié)同作用時caspase-3表達增強更為明顯。提示DDP與PGF促進細胞凋亡具有共同的途徑，這可能是二者在一定時間及一定劑量時產(chǎn)生協(xié)同作用的機制。

1 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential〔J〕.Altern Med Rev,2001;6(1):48-60.

2 Wyllie AH,Kerr JF,Currie AR.Cell death:the significance of apoptosis〔J〕.Int Rev Cytol,1980;68(8):251-306.

3 Lee Y,Chong MJ,McKinnon PJ.Ataxia telangiectasia mutated-dependent apoptosis after genotoxic stress in the developing nervous system is determined by cellular differentiation status〔J〕.J Neurosci,2001;21(17):6687-93.

4 Rao RV,Hermel E,Castro-Obregon S,etal.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.Mechanism of caspase activation〔J〕.J Biol Chem,2001;276(36):33869-74.

5 Bradham CA,Qian T,Streetz K,etal.The mitochondrial permeability transition is required for tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis and cytochrome C release〔J〕.Mol Cell Biol,1998;18(11):6353-64.

6 Nicholson DW,Ali A,Thornberry NA,etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease nessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature,1995;376(6535):37-43.

7 Nicholson DW,Thornberry NA.Caspases:killer proteases〔J〕.Trends Biochem Sci,1997;22(8):299-306.

〔2016-02-17修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

國家自然科學基金面上項目(No.31471312)；黑龍江省自然科學基金面上項目(No.H2015074)；黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃重點項目(No.2016102220234)；佳木斯大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃重點項目(No.2016102220234)

呂冬霞(1965-)，女，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤發(fā)生機制與生物學治療研究。

解嘉志(1991-)，男，在讀本科，主要從事臨床醫(yī)學研究。

R730.52

A

1005-9202(2017)03-0531-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.004