憂遁草枝葉的化學成分及體外抗腫瘤活性研究Δ

黃茂莘，蔡楊靖，劉壽柏，蔡彩虹，王 軍，王 煒，陳 玲，韓鵬定，曾艷波#（.海南省農墾總醫(yī)院藥學部，?？?5703；.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所/海南省黎藥資源天然產物研究與利用重點實驗室，?？?570）

憂遁草枝葉的化學成分及體外抗腫瘤活性研究Δ

黃茂莘1＊，蔡楊靖1，劉壽柏2，蔡彩虹2，王 軍2，王 煒1，陳 玲1，韓鵬定1，曾艷波2#（1.海南省農墾總醫(yī)院藥學部，?？?570311；2.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所/海南省黎藥資源天然產物研究與利用重點實驗室，海口 571101）

目的：研究憂遁草枝葉的化學成分，并初步考察其體外抗腫瘤活性。方法：采用多種柱色譜技術對憂遁草95%乙醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇部位進行分離、純化，根據理化性質和波譜數據分析、鑒定化合物結構。采用MTT法測定鑒定出的化合物對人肝癌BEL-7402細胞、人胃癌SGC-7901細胞和人慢性髓原白血病K562細胞的體外抑制活性。結果：從憂遁草枝葉中分離鑒定出8個化合物，分別為羽扇豆醇（1）、對香豆酸甲酯（2）、1-O-acyl-3-O-（β-D-galactopyranosyl）-sn-glycerol（3）、（6R，10R）-6，10，14-trimethyl-2-pentadecanone（4）、鄰苯二甲酸二（2-乙基-己基）酯（5）、α-D-甲基半乳糖苷（6）、β-D-甲基葡萄糖苷（7）、9-hydroxymegastigma-4，7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside（8）；化合物1對人肝癌BEL-7402細胞具有弱的生長抑制作用（半數抑制濃度為42.5 μmol/L），尚未發(fā)現其他7種化合物對上述3種腫瘤細胞有抑制作用。結論：化合物2～8為首次從憂遁草枝葉中分離得到，羽扇豆醇具有弱的抗人肝癌BEL-7402細胞的活性，該研究為憂遁草的質量評價奠定了一定的基礎。

憂遁草；枝葉；化學成分；鑒定；抗腫瘤；體外

憂遁草全株入藥，具有調經、消腫、祛瘀、止痛、接骨之功效[2]，但是憂遁草的藥用價值一直未受到重視。近年來有報道稱憂遁草可用于末期淋巴癌的治療，其藥用價值由此受到醫(yī)藥學科研工作者的關注，進而業(yè)界對其展開了一系列的研究[3]。為充分挖掘海南產憂遁草資源的藥用價值，合理利用該植物資源，本研究擬對海南產憂遁草枝葉95%乙醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇萃取部位的化學成分進行研究，并初步考察其體外抗腫瘤活性，以為尋找新的生物活性成分提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Brucker AV-500型超導核磁共振儀、Autospec-3000型質譜儀（德國布魯克公司）；ELX-800型酶標儀（美國寶特公司）；IMF-2型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 試劑與色譜材料

GF254高效薄層板和柱層析用硅膠（200～300、60～80目）均購自青島海洋化工廠；羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）和反相C18柱（美國Merck公司）；三菱凝膠吸附樹脂（MCI GEL CHP20P，日本三菱化學公司）；二甲基亞砜（DMSO，廣東西隴化工股份有限公司）；MTT和RMPI 1640培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；小牛血清（美國HyClone公司）；MEM培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖溶液（PBS，北京欣經科生物技術有限公司）；所有試劑均為分析純。

1.3 藥材

憂遁草枝葉于2015年10月采自海南省五指山市，由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所代正福副研究員鑒定為爵床科鱷嘴花屬植物憂遁草[Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau]的枝葉。

1.4 細胞

人肝癌BEL-7402細胞、人胃癌SGC-7901細胞和人慢性髓原白血病K562細胞均購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

稱取憂遁草新鮮枝葉3.0 kg，切碎，室溫下用95%乙醇冷浸提取3次，每次7 d；過濾，合并3次濾液后經真空減壓濃縮得粗浸膏，將其分散于水中成懸濁液；依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得乙酸乙酯萃取物22.8 g、正丁醇萃取物10.6 g。乙酸乙酯萃取物經MCI柱，以30%～100%甲醇-水梯度洗脫，分段收集得到11個流分（Fr.1～Fr.11）；然后Fr.1（631.0 mg）經Sephadex LH-20柱[氯仿-甲醇（1∶1），V/V，下同]，得到Fr.1A、Fr.1B；Fr.1A（33.5 mg）經硅膠色譜柱[氯仿-甲醇（4∶1）]，得到化合物6（4.7 mg）；Fr.3（480.0 mg）經Sephadex LH-20柱（甲醇），得到Fr.3A～Fr.3C；Fr.3C（71.0 mg）通過硅膠色譜柱[石油醚-乙酸乙酯（15∶1）]，得到化合物2（9.4 mg）；Fr.10（7.9 g）經Sephadex LH-20柱（甲醇），得到Fr.10A～Fr.10D；Fr.10D（1.08 g）再經Sephadex LH-20柱[氯仿-甲醇（1∶1）]，得到Fr.10D1～Fr.10D3；Fr.10D1經硅膠柱色譜[石油醚-氯仿（10∶1）]，得到化合物4（8.0 mg）和Fr.10D1A～Fr.10D1D；Fr.10D1C（26.0 mg）經硅膠色譜柱，得到化合物5（6.7 mg）；Fr.10D1B（1.2 g）經硅膠色譜柱分離純化得到化合物1（3.2 mg）和化合物3（1.7 mg）。正丁醇萃取物（10.6 g）經上述色譜技術分離得到化合物7（7.2 mg）和化合物8（2.1 mg）。

2.2 結構鑒定

化合物1：白色粉末，熔點（mp）為215～216℃，分子式為C30H50O；ESI-MS m/z：449[M+Na]+；1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：4.68（1H，s，H-29），4.56（1H，s，H-29），3.18（1H，dd，J＝11.4，4.9 Hz，H-3），2.37（1H，td，J＝11.1，5.8 Hz，H-19），1.91（1H，m，H-21），1.68（3H，s，H-30），1.03（3H，s，H-26），0.96（3H，s，H-23），0.94（3H，s，H-27），0.82（3H，s，H-25），0.78（3H，s，H-28），0.76（3H，s，H-24）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：38.8（C-1），27.6（C-2），79.1（C-3），39.0（C-4），55.4（C-5），18.5（C-6），34.4（C-7），41.0（C-8），50.6（C-9），37.3（C-10），21.1（C-11），25.3（C-12），38.2（C-13），43.0（C-14），27.6（C-15），35.7（C-16），43.1（C-17），48.4（C-18），48.1（C-19），151.1（C-20），30.0（C-21），40.1（C-22），28.1（C-23），15.5（C-24），16.3（C-25），16.1（C-26），14.7（C-27），18.2（C-28），109.5（C-29），19.5（C-30）。以上波譜數據與文獻[4]報道基本一致，故可鑒定化合物1為羽扇豆醇。

化合物2：白色粉末，mp為216～220℃，分子式為C10H10O3；ESI-MS m/z：201[M+Na]+；1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.60（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2，6），6.88（1H，d，J＝12.7 Hz，H-7），6.80（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，5），5.83（1H，d，J＝12.7 Hz，H-8），3.74（3H，s，OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：127.2（C-1），115.3（C-2），130.2（C-3），157.2（C-4），130.2（C-5），115.3（C-6），167.6（C-7），116.4（C-8），144.4（C-9），51.6（-OCH3）。以上波譜數據與文獻[5]報道基本一致，故可鑒定化合物2為對香豆酸甲酯。

化合物3：白色粉末，分子式為C25H48O9；ESI-MS m/z：515[M+Na]+；1H-MNR（CD3OD，500 MHz）δ：4.17（1H，d，J＝7.5 Hz，H-3），4.08（2H，dd，J＝11.5，6.5 Hz，H-1），3.94（1H，m，H-2），3.70（2H，dd，J＝11.0，5.0 Hz，H-3），1.25（24H，brs，H-4′～H-15′），1.57（2H，m，H-3′），2.30（2H，t，J＝7.5 Hz，H-2′），0.85（3H，t，J＝7.0 Hz，H-16′）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：66.6（C-1），70.3（C-2），71.9（C-3），175.5（C-1′），34.9（C-2′），26.0（C-3′），30.0～30.8（C-4′～C-13′），33.0（C-14′），23.7（C-15′），14.4（C-16′），105.3（C-1″），72.6（C-2″），74.8（C-3″），69.6（C-4″），76.7（C-5″），62.5（C-6″）。以上波譜數據與文獻[6]報道基本一致，故可鑒定化合物3為1-O-acyl-3-O-（β-D-galactopyranosyl）-sn-glycerol。

化合物4：無色油狀物，分子式為C18H36O；ESI-MS m/z：291[M+Na]+；1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：2.40（2H，m），2.13（3H，s，H-1），0.86（6H，d，J＝6.5 Hz，H-15，18），0.85（3H，d，J＝6.6 Hz），0.83（3H，d，J＝6.8 Hz），1.60～1.00（19H，m）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：30.0（C-1），209.7（C-2），44.3（C-3），21.6（C-4），36.6（C-5），32.8（C-6），37.4（C-7），24.6（C-8），37.4（C-9），32.9（C-10），37.5（C-11），24.9（C-12），39.5（C-13），28.1（C-14），22.8（C-15），19.7（C-16），19.9（C-17），22.7（C-18）。以上波譜數據與文獻[7]報道基本一致，故可鑒定化合物4為（6R，10R）-6，10，14-trimethyl-2-pentadecanone。

化合物5：無色油狀物，分子式為C24H38O4；ESI-MS m/z：413[M+Na]+；1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.71（2H，dd，J＝3.5，5.6 Hz，H-3，6），7.53（2H，dd，J＝3.5，5.6 Hz，H-4，5），4.22（2H，t，J＝6.0 Hz，H-1′），1.68（2H，m，H-2′），1.42（2H，m，H-1″），1.36（2H，m，H-3′），1.32（2H，m，H-4′），1.30（2H，m，H-5′），0.92（3H，t，J＝7.4 Hz，H-2″），0.89（3H，t，J＝7.3 Hz，H-6′）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：167.9（C-1，8），132.6（C-2，7），128.9（C-3，6），131.0（C-4，5），68.3（C-1′），38.9（C-2′），30.5（C-3′），29.1（C-4′），23.1（C-5′），14.2（C-6′），23.9（C-1″），11.1（C-2″）。以上波譜數據與文獻[8]報道基本一致，故可鑒定化合物5為鄰苯二甲酸二（2-乙基-己基）酯。

化合物6：白色固體，分子式為C7H14O6；ESI-MS m/ z：217[M+Na]+；1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：4.69（1H，d，J＝3.7 Hz，H-1），3.86（1H，d，J＝2.5 Hz，H-2a），3.69（1H，m，H-2b），3.64～3.72（4H，m），3.31（3H，s，-OCH3）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：101.5（C-1），72.3（C-2），71.5（C-3），71.0（C-4），70.2（C-5），62.8（C-6），55.6（-OCH3）。以上波譜數據與文獻[9]報道基本一致，故可鑒定化合物6為α-D-甲基半乳糖苷。

化合物7：白色固體，分子式為C7H14O6；ESI-MS m/ z：217[M+Na]+；1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：4.15（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1），3.85（1H，dd，J＝11.9，1.4 Hz，H-6a），3.66（1H，dd，J＝11.9，5.3 Hz，H-6b），3.51（3H，s，-OCH3），3.33（1H，t，J＝9.0 Hz，H-3），3.30（1H，m，H-4），3.30（1H，m，H-5），3.14（1H，dd，J＝7.9，9.0 Hz，H-2）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：105.4（C-1），75.0（C-2），78.0（C-3），71.6（C-4），77.9（C-5），62.7（C-6），57.3（-OCH3）。以上波譜數據與文獻[10]報道基本一致，故可鑒定化合物7為β-D-甲基葡萄糖苷。

化合物8：白色膠狀物，分子式為C19H30O7；ESI-MS m/z：393[M+Na]+；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：5.91（1H，s，H-4），5.77（1H，dd，J＝15.4，9.3 Hz，H-7），5.61（1H，dd，J＝15.4，7.5 Hz，H-8），4.50（1H，m，H-9），4.31（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1′），3.87（1H，dd，J＝11.9，2.2 Hz，H-6′α），3.65（1H，dd，J＝11.9，6.2 Hz，H-6′β），3.30～3.15（4H，m，H-2′～5′），2.72（1H，d，J＝9.2 Hz，H-6），2.50（1H，d，J＝16.9 Hz，H-2），2.08（1H，d，J＝16.9 Hz，H-2），2.00（3H，s，H-13），1.31（3H，d，J＝6.4 Hz，H-10），1.05（3H，s，H-11），1.01（3H，s，H-12）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：202.1（C-3），165.8（C-5），137.0（C-8），131.2（C-7），126.2（C-4），101.2（C-1′），78.4（C-3′），78.2（C-5′），75.0（C-2′），74.8（C-9），71.7（C-4′），62.8（C-6′），56.9（C-6），37.2（C-1），28.0（C-12），27.4（C-11），23.9（C-13），22.2（C-10）。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故可鑒定化合物8為9-hydroxy-megastigma-4，7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside。

2.3 抗腫瘤活性考察

采用MTT法[12]進行測定。將腫瘤細胞分別培養(yǎng)于含有10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，于含5%CO2、濕度＞90%、37℃恒溫箱中培養(yǎng)，貼壁細胞用0.25%的胰酶消化。同時，設置陰性對照組（溶劑DMSO）、陽性對照組（紫杉醇）和6個質量濃度的待測樣品組（0.003 125、0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1μg/mL，化合物1～8），各3份。選取對數生長期的細胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基制成單細胞懸浮液，用血球計數板計數，調整細胞密度為50 000個/mL，接種90 μL于96孔平底細胞培養(yǎng)板中，置于含5%CO2、濕度＞90%、37℃恒溫箱中培養(yǎng)。在K562細胞中直接加入待測樣品10 μL，BEL-7402和SGC-7901細胞培養(yǎng)24 h后加入待測樣品10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后取出，置于倒置顯微鏡下觀察每孔細胞的生長形態(tài)。然后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液（溶于PBS）15 μL，37℃反應4 h后，吸去上清液，再向各孔加入100 μL DMSO，充分溶解。將96孔平底細胞培養(yǎng)板置于酶標儀上，于490 nm波長處測量各孔的光密度，計算生長抑制率[生長抑制率（%）＝（1－給藥組光密度平均值/陰性對照組光密度平均值）× 100%]。以待測樣品質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、細胞生長抑制率（y，%）為縱坐標，利用Origin 8.0軟件擬合抑制率曲線圖，抑制率為50%時的樣品濃度，即為細胞毒活性的半數抑制濃度（IC50）值?；钚詼y試結果表明，化合物1對人肝癌BEL-7402細胞有弱的生長抑制活性，其IC50值為42.5μmol/L（陽性對照組為5.72μmol/L），其余7種化合物對3種細胞均未見抑制作用。

3 討論

目前，憂遁草中已報道的化合物結構類型豐富，包括三萜類[13]、甾醇類[13]、黃酮碳苷[14]、含硫糖苷類[15]等，這些化學成分大部分已被現代藥理實驗研究證實具有抗腫瘤作用[16-17]。本研究利用多種柱色譜技術，從海南產憂遁草乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分離得到6個化合物、正丁醇萃取部位分離得到2個化合物，其中化合物2～8為首次從該植物中分離得到。體外抗腫瘤活性試驗結果表明，化合物1對人肝癌BEL-7402細胞有弱的生長抑制活性，其他化合物對除上述3種之外的腫瘤細胞有無抑制作用有待進一步研究證實。本研究豐富了憂遁草化學成分的多樣性，為憂遁草的質量評價奠定了一定基礎。

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Study on the Chemical Constituents of Clinacanthus nutans Branches and Leaves and Its Anti-tumor Activity in vitro

HUANG Maoxin1，CAI Yangjing1，LIU Shoubai2，CAI Caihong2，WANG Jun2，WANG Wei1，CHEN Ling1，HAN Pengding1，ZENG Yanbo2（1.Dept.of Pharmacy，Hainan Nongken General Hospital，Haikou 570311，China；2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Key Laboratory for Research and Development of Natural Products from Li Folk Medicine，Haikou 571101，China）

OBJECTIVE：To study the chemical constituents of Clinacanthus nutans branches and leaves and its anti-tumor activity in vitro.METHODS：Varied chromatographic techniques were conducted to separate and purify the ethyl acetate and butanol parts of 95%ethanol extracts of C.nutans，the chemical structures were analyzed and identified according to physicochemical property and spectral data.MTT method was used to determine the inhibitory activity of identified compounds on human liver cancer BEL-7402 cell lines，gastric cancer SGC-7901 cell lines and chronic myelogenous leukemia K562 cell lines in vitro.RESULTS：Eight compounds isolated from C.nutans branches and leaves were identified as lupeol（1），methyl p-coumarate（2），1-O-acyl-3-O-（β-D-galactopyranosyl）-sn-glycerol（3），（6R，10R）-6，10，14-trimethyl-2-pentadecanone（4），1，2-benzenedicarboxylic acid bis（2-ethylhexyl）ester（5），methyl α-D-galactopyranoside（6），methyl β-D-glucopyranoside（7），9-hydroxy-megastigma-4，7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside（8）.Compound 1 had weak growth inhibition effect on human liver cancer BEL-7402 cell（half inhibitory concentration was 42.5 μmol/L），the other 7 compounds had not been found to inhibit the above 3 tumor cell lines.CONCLUSIONS：Compounds 2-8 are all isolated from C.nutans branches and leaves for the first time，while lupeol has weak growth inhibition effect on human liver cancer BEL-7402 cell.The study has laid the foundation for the quality evaluation of C.nutans.

Clinacanthus nutans；Braches and leaves；Chemical constituents；Identification；Anti-tumor；in vitro憂遁草[Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau]是爵床科鱷嘴花屬植物，別名鱷嘴花、扭序花、竹節(jié)黃、小接骨、沙巴蛇草、柔刺草等，廣泛分布于華南熱帶至中南半島、馬來半島、爪哇和加里曼丹[1]。在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中，

R917

A

1001-0408（2017）07-0895-04

2016-11-16

2017-01-10）

（編輯：劉明偉）

海南省衛(wèi)生和計劃生育委員會2014年度普通醫(yī)學科研項目（No.14A210221）

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學。電話：0898-66808275。E-mail：wnhuangmx@163.com

#通信作者：副研究員，博士。研究方向：天然產物化學。電話：0898-66968571。E-mail：zengyanbo@itbb.org.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.09