斜帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒主衣殼蛋白的原核表達(dá)與純化研究

（斯澳生物科技（蘇州）有限公司，江蘇蘇州 215123）

作為我國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的重要品種之一，神經(jīng)壞死病毒是導(dǎo)致其死亡的主要原因之一[1]。目前臨床上尚未研究出治療這種病毒的藥物，因此通過(guò)疫苗進(jìn)行防治是降低斜帶石斑魚(yú)死亡率的基本途徑[2]。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本文以大腸桿菌為載體，對(duì)斜帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒（OGNNV）主衣殼蛋白（MCP）基因進(jìn)行融合[3]，現(xiàn)將整個(gè)融合表達(dá)流程分析如下：

1 材料與方法

1.1 材料

①表達(dá)受體菌株。本研究采用BL21作為分析OGNNV MCP原核表達(dá)及純化過(guò)程的菌株，獲取途徑為購(gòu)買。②重組質(zhì)粒。選用pET32a-MCP作為基因融合實(shí)驗(yàn)的重組質(zhì)粒，獲取方式為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。③試劑。本研究試劑主要包含IPTG、抗狼鱸神經(jīng)壞死病毒單克隆抗體hc3、LA培養(yǎng)基以及相關(guān)分析純。

1.2 方法

1.2.1 原核重組菌獲取方法

按照規(guī)范實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建重組表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。上述流程完成后，于第2d于轉(zhuǎn)化LA平板中選取新長(zhǎng)出單菌落，即獲得含有斜帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒主衣殼蛋白基因的原核重組菌（BL21）。

1.2.2 融合蛋白表達(dá)方法

從轉(zhuǎn)化平板中新生的陽(yáng)性菌落中選取一株，將其置入LA液體培養(yǎng)基中。保持實(shí)驗(yàn)室室溫穩(wěn)定在37℃左右，將陽(yáng)性菌落活化過(guò)夜。第2d以1%（V/V）比例將LA培養(yǎng)基中的陽(yáng)性菌落再次轉(zhuǎn)接于新鮮LA培養(yǎng)基中。當(dāng)陽(yáng)性菌A600的培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到0.6～1.0范疇時(shí)，向LA培養(yǎng)基中加入100mmol/L IPTG，此時(shí)，LA液體培養(yǎng)基中的濃度將達(dá)到1mmol/L，根據(jù)陽(yáng)性菌落的生長(zhǎng)狀況培養(yǎng)2-3h。

1.2.3 SDS-PAGE分析方法

培養(yǎng)成功后，取1mL菌液，以12000r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)菌液進(jìn)行離心處理。離心時(shí)間為1min。離心完成后，收集離心后的菌體，開(kāi)展SDS-PAGE分析。

1.2.4 鑒定方法

參照《Western-blot kit》《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法規(guī)定，對(duì)電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜中的SDS-PAGE蛋白進(jìn)行鑒定分析。

1.2.5 可溶性分析方法

參照規(guī)范流程對(duì)重組菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)，快速促使其表達(dá)。經(jīng)離心處理后，收集表達(dá)后的BL21菌體。混入適量1XPBS，促使沉淀菌體重懸。對(duì)菌體進(jìn)行冰浴處理后，借助超聲波設(shè)備使得BL21菌液變?yōu)槌吻鍫顟B(tài)。取1ml菌液，于4℃溫度下12000rpm持續(xù)離心10min，取離心后上清液、沉淀逐一開(kāi)展SDS-PAGE分析。

1.2.6 純化方法

在正式進(jìn)行純化處理前，需按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中包含體粗提、洗滌的規(guī)定，進(jìn)行相應(yīng)處理。于PBS緩沖液中加入適量濃度為8mol/L的尿素，將經(jīng)過(guò)洗滌處理后的包涵體浸入PBS緩沖液中，進(jìn)行溶解。利用Ni-NTA-Agarose柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行層析純化。將融合蛋白置入透析液中，持續(xù)透析36～48h，最終取10μl開(kāi)展SD-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 鑒定結(jié)果

融合蛋白的鑒定結(jié)果顯示，Westerm-blot及SDS-PAGE中均包含一條特意性表達(dá)帶，且其位置均位于55.3 kDa區(qū)域。斜帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒主衣殼蛋白基因編碼的氨基酸序列相對(duì)分子量（理論值）為37 kDa，由于其原核表達(dá)過(guò)程與一段多肽與目基因發(fā)生融合，因此所得融合蛋白分子量為上述兩種基因的分子量之和，為55.3 kDa。這兩種鑒定方法均證實(shí)：重組菌中，OGNNV MCP基因可正確表達(dá)。

2.2 可溶性分析結(jié)果

可溶性分析結(jié)果顯示：研究所需目的蛋白多位于沉淀中，因此可認(rèn)為OGNNV MCP的原核表達(dá)產(chǎn)物以不可溶狀態(tài)的包涵體為主要形式。

2.3 純化結(jié)果

經(jīng)過(guò)溶解及Ni-NTA-Agarose層析處理后，融合蛋白的純化度高達(dá)90%。

2.4 表達(dá)結(jié)果

上述研究證實(shí)，重組菌的生長(zhǎng)及表達(dá)融合蛋白的條件范圍較為廣泛[4]。但為了縮減重組菌的表達(dá)成本，可將最佳條件確定為：LA培養(yǎng)基內(nèi)混入0.5%葡萄糖，溶液pH=7.0，在37℃條件下培養(yǎng)至A600=0.8-1.0，加入IPTG，使得溶液終濃度達(dá)到1mmol/L，持續(xù)誘導(dǎo)2～3h。

3 討論

上述研究表明，OGNNV MCP的表達(dá)能夠促使免疫動(dòng)物在刺激作用下對(duì)OGNNV產(chǎn)生抗體?；谏鲜龇治鼋Y(jié)果，在選擇表達(dá)系統(tǒng)的過(guò)程中，應(yīng)將具有易進(jìn)行純化表達(dá)特征、可獲取大量目的蛋白特征的大腸桿菌作為抗原的表達(dá)系統(tǒng)。

此外，與空載體菌相比，重組菌格外多出一條55.3 kDa的帶，該條帶具有與抗狼鱸神經(jīng)壞死病毒單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的作用[5]。

4 結(jié)論

可利用大腸桿菌完成OGNNV MCP的表達(dá)、純化。

[1]陳曉艷，何建國(guó).原位雜交技術(shù)在斜帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)中的應(yīng)用[J].海洋科學(xué)，2011，（6）：1-4.

[2]陳曉艷，翁少萍，殷志新，等.斜帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒主衣殼蛋白的原核表達(dá)與純化[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，（6）：83-86.