不同飼料添加劑對(duì)肉羊瘤胃液體外發(fā)酵及甲烷排放量的影響

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130033）

目前，我國畜牧業(yè)正由粗放型向集約化轉(zhuǎn)變的過程中，尤其是肉羊養(yǎng)殖業(yè)正經(jīng)歷重大的飼養(yǎng)管理方式變革，對(duì)精細(xì)化和生態(tài)化飼養(yǎng)管理技術(shù)的需求十分迫切，加之我國對(duì)環(huán)境保護(hù)越來越重視，已經(jīng)成為我國的基本國策。通過營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)實(shí)現(xiàn)肉羊養(yǎng)殖的低碳生產(chǎn)，不僅符合我國國民經(jīng)濟(jì)和現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的方向，而且契合我國現(xiàn)階段肉羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)需求。甲烷是一種生物源性溫室氣體，其溫室效應(yīng)是二氧化碳的23倍。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的甲烷是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最主要的溫室氣體來源，成為影響氣候變化的重要影響因素，不但造成飼料資源的巨大浪費(fèi)，還對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的威脅[1-3]。因此，反芻家畜甲烷代謝調(diào)控已成為畜牧領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，具有環(huán)境和經(jīng)濟(jì)的雙重效應(yīng)。

反芻動(dòng)物瘤胃中產(chǎn)生的甲烷主要來源于日糧中碳水化合物（CHO）的降解過程。日糧中的有機(jī)物在瘤胃中被微生物分解，產(chǎn)生氫氣（H2）和含有甲基的初級(jí)發(fā)酵產(chǎn)物（如甲酸、甲胺、甲醇和乙酸等），產(chǎn)甲烷菌可以將這些初級(jí)發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為甲烷，并以此獲得生命活動(dòng)所需的能量。H2還原CO2是瘤胃中甲烷產(chǎn)生的主要途徑，而甲酸是僅次于H2和CO2的甲烷生成底物。瘤胃中產(chǎn)生甲烷的生化反應(yīng)機(jī)制有CO2-H2還原途徑、甲酸、乙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸（VFA）分解途徑以及甲醇等甲基化合物分解途徑，其中CO2-H2還原途徑是瘤胃中甲烷產(chǎn)生的主要來源，所產(chǎn)甲烷占反芻動(dòng)物甲烷總產(chǎn)量的80%以上。反芻動(dòng)物甲烷排放量主要受日糧組成的影響，與纖維含量密切相關(guān)，當(dāng)日糧中纖維含量增加時(shí)，刺激纖維素分解菌增殖，瘤胃主要進(jìn)行乙酸發(fā)酵，產(chǎn)生大量H2，從而促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌大量增殖，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量增加。瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)生同時(shí)受到日糧中氮源的影響。瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成需要日糧提供所需的碳源和氮源，滿足對(duì)兩者的需要，才能達(dá)到微生物的最佳產(chǎn)量。目前，國際上反芻動(dòng)物甲烷減排的營養(yǎng)調(diào)控措施包括：日糧組成調(diào)控、生物學(xué)調(diào)控、電子傳遞調(diào)控、植物提取物調(diào)控等幾種主流調(diào)控方式，其中除日糧組成調(diào)控外其余措施均可通過在日糧中使用不同類型的添加劑從而達(dá)到減低甲烷排放量提高瘤胃發(fā)酵功能的目的[4、5、6]。本試驗(yàn)以羊草作為試驗(yàn)動(dòng)物主要飼料原料，采用吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主研發(fā) “六通路瞬時(shí)發(fā)酵微量產(chǎn)氣全自動(dòng)記錄裝置與軟件系統(tǒng)”，對(duì)五種飼料添加劑對(duì)甲烷作用效果和瘤胃發(fā)酵功能進(jìn)行對(duì)比，以期獲得適宜在肉羊生產(chǎn)中應(yīng)用推廣的甲烷抑制劑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用羊草采自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院肉羊養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)，營養(yǎng)成分如下：干物質(zhì)88.31%、粗蛋白9.89%，中性洗滌纖維30.87%，粗脂肪2.76%，粗灰分4.81%，能量19.12kJ/g。莫能菌素純度99%，規(guī)格2000萬單位；活性炭，黑色顆粒狀，粉碎后用40目篩網(wǎng)過濾；綠茶提取物（純度90%，茶多酚20%-98%）；酵素，枯草芽孢桿菌（≥3*108cfu/ml）、釀酒酵母菌（≥2*108cfu/ml）植物乳桿菌克（≥2*108cfu/ml）；硝酸鈉（純度99%，分析純）。

1.2 供試動(dòng)物及瘤胃液的采集

在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院選用3頭裝有永久性瘤胃瘺管的東北肉羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)羊以羊草作為唯一飼料來源，取瘤胃液前預(yù)飼期7d，每天飼喂2次（6：00和18：00），自由飲水。于每日晨飼后兩小時(shí)（8：00）抽取瘤胃液，混合后裝于保溫瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，用4層紗布過濾，同時(shí)通入氮?dú)?。試?yàn)過程中發(fā)酵裝置始終保持39±0.1℃，緩沖液pH值6.8。

1.3 體外發(fā)酵

體外發(fā)酵裝置采用吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院自主研制的“六通路瞬時(shí)發(fā)酵微量產(chǎn)氣全自動(dòng)記錄裝置與軟件系統(tǒng)”（圖1）。稱1.5g羊草作為發(fā)酵底物與相應(yīng)的添加劑，提前放入6個(gè)容積為300ml的白鋼發(fā)酵罐內(nèi)，每個(gè)發(fā)酵罐提前預(yù)熱并通入氮?dú)猓瑴囟冗_(dá)到39℃后各發(fā)酵罐中裝入50ml瘤胃液，并加入100ml人工唾液原液。發(fā)酵罐密封后放入恒溫水浴搖床內(nèi)（頻率為85次/分）。數(shù)據(jù)采集儀器每間隔1min，依次（A-F）單獨(dú)采集各發(fā)酵罐內(nèi)氣體數(shù)據(jù)，每6min循環(huán)一次，分析儀為集成一體機(jī)，利用單獨(dú)的甲烷（德國SENSORSEUROPE公司）、二氧化碳（德國SENSORSEUROPE公司）、氧氣（美國AMI公司）和氫氣（英國CITY公司）濃度傳感器對(duì)氣體進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 六通路瞬時(shí)發(fā)酵微量產(chǎn)氣全自動(dòng)記錄裝置與軟件系統(tǒng)

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，發(fā)酵罐內(nèi)的循環(huán)時(shí)間間隔為1min，試驗(yàn)重復(fù)5次，每次試驗(yàn)連續(xù)發(fā)酵12h。各添加劑的添加量為底物（羊草）的2%，因不同添加劑有純度差異，使各添加量有所不同，具體如下：莫能菌素30mg，綠茶提取物35mg，硝酸鈉45mg，活性炭40mg，酵素110mg，對(duì)照組無添加劑。

1.5 樣品采集及分析

甲烷、二氧化碳和氫氣產(chǎn)量由數(shù)據(jù)分析儀采集并直接記錄。發(fā)酵12h后將發(fā)酵液用4層紗布過濾，按發(fā)酵液相應(yīng)的比例加入25%的偏磷酸，混合后用10000×g離心10min，之后于-20℃冷凍保存，用于揮發(fā)性脂肪酸（VFA）測(cè)定，VFA用氣相色譜外標(biāo)法測(cè)定，發(fā)酵結(jié)束后立即用pH計(jì)測(cè)定各發(fā)酵罐中發(fā)酵液的pH值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2007進(jìn)行初步整理，采用spss 19軟件中的MIXED模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平為P＜0.05，并采用Duncan方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 添加劑對(duì)肉羊體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

由表1可知，硝酸鈉和莫能菌素組對(duì)甲烷產(chǎn)生量的抑制效果最為顯著（P＜0.05），分別下降了28.49%和16.42%?；钚蕴?、綠茶提取物對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響并不顯著（P﹥0.05）。酵素組與對(duì)照組相比甲烷產(chǎn)生量提高了3.7%。二氧化碳排放量硝酸鈉顯著高于對(duì)照組和莫能菌素（P＜0.05），綠茶提取物和酵素與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。氫氣產(chǎn)生量硝酸鈉和綠茶提取物，顯著高于對(duì)照組和莫能菌素（P＜0.05）。

2.2 添加劑對(duì)肉羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸的影響

由表2可知，對(duì)照組和五種添加劑乙酸、丙酸、丁酸濃度均發(fā)酵后均顯著高于發(fā)酵前（P＜0.05）。五種添加劑和對(duì)照組相比乙酸、丙酸、丁酸濃度均未達(dá)到顯著水平（P﹥0.05）。

3 討論

3.1 硝酸鹽

已有研究報(bào)道：硝酸鹽類物質(zhì)可作為非蛋白類氮源促進(jìn)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵功能。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)生，主要依靠4H2+HCO3-+H+→CH4+3H2O的還原途徑，是消耗瘤胃內(nèi)多H2的重要途徑。硝酸鹽類物質(zhì)進(jìn)入瘤胃后，首先被還原成亞硝酸鹽再被還原為氨，在這一過程中需消耗瘤胃內(nèi)部分 H2，同時(shí)硝酸根離子具有較強(qiáng)氧化性，與甲烷菌 CO2-H2的還原途徑相比更有利于被 H2還原。Amlan[7]和趙麗萍[8]等研究認(rèn)為：合理計(jì)量的硝酸鹽類物質(zhì)進(jìn)入瘤胃后作為電子受體，可有效降低甲烷排放量。本研究中以羊草為發(fā)酵底物，添加2%的硝酸鹽后甲烷排放量降低了28.49%，與對(duì)照組相比僅丙酸濃度有下降趨勢(shì)，但未達(dá)顯著水平，說明硝酸鹽未損害瘤胃發(fā)酵功能，與上述研究結(jié)果相一致。但硝酸鹽作為電子受體，如短時(shí)間大量進(jìn)入反芻瘤胃后，轉(zhuǎn)化過程中如亞硝酸鹽含量超過了微生物將其轉(zhuǎn)化為氨的能力時(shí)，就會(huì)造成亞硝酸鹽中毒，所以使用時(shí)必須嚴(yán)格控制添加計(jì)量，這也在一定程度上限制了硝酸鹽在肉羊生產(chǎn)中的使用和推廣。

3.2 莫能菌素

眾多研究表明[9、10]莫能菌素能影響反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)能量代謝，改善瘤胃發(fā)酵功能，降低乙酸與丙酸的產(chǎn)出比例，從而減少甲烷排放，提高日糧利用率及生產(chǎn)性能，已廣泛應(yīng)用于反芻動(dòng)物生產(chǎn)。Montoy的研究表明[11]，以青貯玉米為底物進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)，添加0.0015mg/ml至0.003mg/ml的莫能菌素可以有效抑制甲烷排放量達(dá)30%～50%，但并未影響VFA濃度。本研究中莫能菌素組與對(duì)照組相比甲烷排放量降低了16.42%，減排量與報(bào)道差別較大，原因可能為發(fā)酵底物不同所致，但減排效果同樣顯著。VFV濃度與對(duì)照組相比未發(fā)生明顯變化。近年來，食品安全越來越受到消費(fèi)者的重視，莫能菌素作為抗生素類添加劑，已被歐盟等發(fā)達(dá)國家禁止使用，尋找抗生素類替代品是畜牧業(yè)科研工作急需解決的問題。

3.3 綠茶提取物

植物提取物的有效成分主要為植物次生代謝產(chǎn)物。植物的次生代謝產(chǎn)物是植物自我保護(hù)的一種機(jī)制因?yàn)槠渚哂锌咕钚运杂脕矸乐共菔硠?dòng)物攝食和病菌等的侵入，在進(jìn)入反芻動(dòng)物瘤胃后通過改變其他細(xì)菌的活性來影響瘤胃內(nèi)甲烷菌從而影響反芻動(dòng)物的瘤胃產(chǎn)甲烷量。Mao等研究表明[12]：綠茶提取物中含有大量的皂苷類物質(zhì)，當(dāng)在肉羊日糧中添加使用時(shí)甲烷產(chǎn)生量被顯著降低27%。在本研究中綠茶提取與對(duì)照組相比甲烷排放量和VFA濃度均未表現(xiàn)出顯著差異，原因可能是添加劑量及發(fā)酵底物不同，不能達(dá)到有效抑制瘤胃甲烷菌群活性的目的。

3.4 活性炭

研究表明[13]，在水稻生產(chǎn)中使用活性炭可降低甲烷的產(chǎn)生量，因?yàn)榛钚蕴渴蔷哂卸嗫仔缘奈镔|(zhì)，吸附能力較強(qiáng)，當(dāng)活性炭與飼草或青貯的混合會(huì)提供一種理想的系統(tǒng)，可以在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)通過吸附甲烷氣體，從而降低甲烷產(chǎn)生量，同時(shí)不影響瘤胃發(fā)酵功能。這個(gè)結(jié)果說明在以干草做底物時(shí)添加活性炭并不會(huì)使甲烷產(chǎn)量發(fā)生明顯改變，對(duì)VFA濃度也沒有影響。這與本研究的結(jié)果相一致。Sand S I[14]等研究發(fā)現(xiàn)，體外發(fā)酵試驗(yàn)中當(dāng)活性炭與硝酸鹽類物質(zhì)混合后，降低甲烷產(chǎn)量效果優(yōu)于硝酸鹽類物質(zhì)單獨(dú)添加。其原因可能是因?yàn)榛钚蕴靠梢源龠M(jìn)嗜甲烷菌的產(chǎn)生，其菌種特點(diǎn)是可以將甲烷作為唯一的碳源和能源，從而使瘤胃內(nèi)甲烷含量降低?；钚蕴颗c硝酸鹽混合使用，也許可為硝酸鹽類物質(zhì)在肉羊生產(chǎn)中的推廣使用提供新的途徑。

表1 不同添加劑對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

表2 不同添加劑對(duì)瘤胃液VFA濃度的影響

3.5 酵素

酵素是指植物進(jìn)行深層發(fā)酵，提取的一種含生物活性物質(zhì)的低鹽液體。其生物活性成分包括酶、發(fā)酵參與菌?？捎绊懶笄蒹w內(nèi)酶活性，從細(xì)胞層面調(diào)節(jié)機(jī)體的生命活動(dòng)。酵素飼料添加劑一般是由多種益生菌株，運(yùn)用生物發(fā)酵及復(fù)方配伍技術(shù)研制開發(fā)的一種綠色安全、無藥物應(yīng)激和藥物殘留的新型動(dòng)物保健添加劑，在畜禽生產(chǎn)中具有抗應(yīng)激、促免疫、健腸胃、促消化的功效，通過增強(qiáng)畜禽機(jī)體性能，間接提高飼料利用率，目前多用于單胃動(dòng)物生產(chǎn)，在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用的研究報(bào)道較少。本研究中酵素對(duì)VFA濃度影響未達(dá)顯著水平，反而增加了甲烷排放量，可能是由于酵素內(nèi)多種酶的存在，促進(jìn)了瘤胃內(nèi)甲烷合成反應(yīng)的進(jìn)行，所導(dǎo)致的，其原因有待進(jìn)一步論證。

4 小結(jié)

肉羊瘤胃液體外發(fā)酵以羊草為底物的研究中：綠茶提取物、活性炭、酵素在甲烷產(chǎn)生量和VFA的濃度變化都未達(dá)顯著效果，故對(duì)瘤胃發(fā)酵能沒有影響。硝酸鹽不僅對(duì)甲烷產(chǎn)生量有顯著的抑制效果，同時(shí)未改變VFA濃度，且作用效果優(yōu)于莫能菌素，是肉羊生產(chǎn)中較為理想的潛在甲烷抑制劑。

[1]樂群，張國君，王錚.中國各省甲烷排放量初步估算及空間分布[J].地理研究，2012，31（9）：1559-1570.

[2]孫雨坤，趙玉民，閆曉剛，等.反芻動(dòng)物甲烷代謝測(cè)定方法及其調(diào)控技術(shù)的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016，（8）：41-44.

[3]馮汝涵.畜牧業(yè)與溫室氣體排放[J].草業(yè)與畜牧，2010，（8）：50-51.

[4]金恩望，王加啟，卜登攀，等.利用體外產(chǎn)氣法研究植物精油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵和甲烷生成的影響[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，18（3）：120-127.

[5]Feng Ruhan.Animal husbandry and greenhouse gas emissions[J].Prataculture and Animal Husbandry，2010，（8）：50-51.

[6]Beauchemin K A，Kreuzer M，O’Mara F，McAllister T A.Nutritional management for enteric methane abatement：a review[J].Australian Journal of Experimental Agriculture，2008，（48）：21-27.

[7]Amlan K P，Yu Z T.Combinations of nitrate，saponin，and sulfate additively reduce methane production by rumen cultures in vitro while not adversely affecting feed digestion，fermentation or microbial communities[J].Bioresource Technology，2014，（155）：129-135.

[8]趙麗萍.硝酸鹽對(duì)肉牛瘤胃發(fā)酵、微生物多樣性、血液生化及抗氧化性能的影響[D].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[9]李俐，劉小可，閆宏.日糧營養(yǎng)水平和添加莫能菌素對(duì)肉牛生產(chǎn)性能的影響[J].飼料工業(yè)，2012，（13）：41-44.

[10]陳志強(qiáng)，李愛華，洪龍，等.全混合日糧中添加莫能菌素對(duì)肉牛育肥效果的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，（3）：67-69.

[11]Montoya J C，Campeneere S D，Ranst G V，et al.Interactions between methane mitigation additives and basal substrates on in vitro methane and VFA production[J].Animal Feed Science and Technology，2012，（176）：47- 60.

[12]Mao H L，Wang J K，Zhou Y Y，et al.Effects of addition of tea saponins and soybean oil on methane production，fermentation and microbial population in the rumen of growing lambs[J].Livestock Science，2010，（129）：56-62.

[13]Pereiraa R C，Muetzelb S，Arbestaina M C，et al.Assessment of the influence of biochar on rumen and silagefermentation：A laboratoryscale experiment[J].Animal Feed Science and Technology，2014，（196）：22-31.

[14]Sand S I，Preston T R.Biochar lowers net methane production from rumen fluid in vitro[J].Livestock Research for Rural Development，2012，（6）：24.

[15]Rhayour K，Bouchikhi T，Tantaoui-elaraki A，et al.The mechanism of bactericidal action of oregano and clove essential oils and of their phenolic major components on escherichia coli and bacillus subtilis[J].Joutnanl of Essential Oil Research，2003，（15）：286-292.