幾種常見細胞衰老檢測指標的比較

張譯元，肖芳

（中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系，湖南長沙410078）

幾種常見細胞衰老檢測指標的比較

張譯元，肖芳

（中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系，湖南長沙410078）

細胞衰老是一種不可逆的生長停滯現(xiàn)象，可由各種不同的細胞應(yīng)激觸發(fā)。目前，在細胞衰老研究中涉及的檢測指標包括衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶、端粒和端粒酶、衰老相關(guān)的異染色質(zhì)灶、衰老相關(guān)的分泌表型、活性氧簇以及腫瘤抑制基因p53和p16等。這些檢測指標在衰老研究中被廣泛應(yīng)用，各具特點，同時優(yōu)缺點并存。本文綜述幾種常見的細胞衰老檢測指標，并對其準確性、可信性、特異性和適用范圍等方面進行比較。

細胞衰老；檢測；指標

細胞衰老是一種不可逆的生長停滯現(xiàn)象，可由各種不同的細胞應(yīng)激觸發(fā)，包括DNA損傷、癌基因激活、氧化應(yīng)激和外源性毒物暴露等［1］。事實上，衰老并不等同于死亡，衰老的細胞在相當一段時間內(nèi)仍保持一定的代謝活性。除了細胞周期阻滯，衰老細胞還經(jīng)歷形態(tài)、生化和生理功能上的改變，如放大扁平的細胞形態(tài)、褐脂素的積累、DNA損傷的出現(xiàn)、多種基因表達的改變、促炎癥細胞因子和其他因子的分泌等［2-3］。關(guān)于衰老機制的研究存在諸多理論及假說，如遺傳學(xué)說、損傷累積學(xué)說、端粒學(xué)說和內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)學(xué)說等。首先，遺傳學(xué)說認為，增殖基因表達下調(diào)及生長抑制基因表達上調(diào)導(dǎo)致衰老的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，細胞在p53，p 21，Rb和p16等衰老相關(guān)基因作用下發(fā)生老化，衰老細胞因分裂增殖停滯而不可能發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，暗示衰老實際上是一種機體自我防御的保護性腫瘤逃逸機制［4］。其次，損傷累積學(xué)說認為，衰老是在內(nèi)外環(huán)境的共同作用下，修復(fù)能力下降導(dǎo)致細胞不斷累積錯誤。1956年Harman［5］首次提出，由于機體不斷產(chǎn)生自由基，損傷細胞膜，增加DNA突變，造成功能蛋白無法正常合成，從而導(dǎo)致衰老。在線粒體中有1%～4%的氧轉(zhuǎn)換為氧自由基，即活性氧簇（reactiveoxygen species，ROS）。線粒體DNA（mitochon?drialDNA，mtDNA）在線粒體基質(zhì)中缺乏保護而發(fā)生突變引起呼吸鏈受損，進一步引起ROS堆積，惡性循環(huán)導(dǎo)致衰老［6］。此外，衰老的端粒學(xué)說認為，端粒DNA序列會隨著細胞每次分裂逐漸丟失，最終造成細胞的衰老及死亡。盡管對衰老這一復(fù)雜過程的闡述已存在上述諸多理論和假說，但仍未形成一致的觀點。目前在細胞衰老研究中涉及的檢測指標包括：衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（β-galactosi?dase，β-gal）、端粒和端粒酶、衰老相關(guān)的異染色質(zhì)灶（senescence-associated heterochromatin foci，SAHF）、衰老相關(guān)的分泌表型（senescence-asso?ciated secretory phenotype，SASP）、P53及P16通路等。這些檢測指標被廣泛應(yīng)用，各具特點，同時優(yōu)缺點并存。鑒于衰老與腫瘤的關(guān)系，外源性化學(xué)物導(dǎo)致衰老的發(fā)生發(fā)展及其分子機制的研究目前仍是毒理學(xué)的熱點，故本文比較幾種常見細胞衰老檢測指標，以期為毒理學(xué)及其他領(lǐng)域衰老研究中檢測指標的選擇以及衰老分子機制的闡明提供線索。

1 衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶

β-gal是應(yīng)用最早且最廣泛的一種源于溶酶體的衰老標志物［7］，能夠在衰老細胞中增加溶酶體生物合成，被認為是細胞衰老特異性的標志物以及衰老檢測的金標準［8］。Dimri等［9］收集不同年齡志愿者的皮膚樣本后提取細胞進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的真皮成纖維細胞和表皮角質(zhì)細胞中檢測到，β-gal（pH=6）含量隨年齡增加而增加，首次證明這種標志物在體內(nèi)隨著細胞老化而逐漸積累增多。此外，Pati等［10］通過改變pH和孵育時間等實驗條件對老年犬的皮膚樣本進行常規(guī)的β-gal染色，發(fā)現(xiàn)其毛囊細胞和皮脂腺細胞中β-gal的活性增加；同時也發(fā)現(xiàn)延長孵育時間可明顯增加染色強度，提示即使是正常細胞在長時間染色條件下也有可能被染色。然而其他研究顯示，在某些實驗條件下非衰老細胞也表現(xiàn)出β-gal活性的增加［11］。Cristofalo［12］和Lee等［8］同樣證實了細胞在長期或高密度培養(yǎng)條件下也可檢測到β-gal的活性。此外，Severino等［13］比較不同年齡不同文化捐獻者的組織切片、培養(yǎng)細胞和病毒永生化細胞，確認低密度培養(yǎng)H2O2誘導(dǎo)的衰老細胞中β-gal的活性明顯增加，但檢測衰老者體內(nèi)分離出來的原代皮膚細胞時β-gal未發(fā)現(xiàn)任何變化。因此，將β-gal作為衰老生物標志物進行檢測時，考慮到染色時間長短以及細胞培養(yǎng)密度大小等因素的干擾，應(yīng)對染色條件進行嚴格控制，以獲得準確的結(jié)果。

2 端粒和端粒酶

端粒是一種染色體末端的核蛋白復(fù)合物，其對于染色體的保護和基因組的穩(wěn)定有著十分重要的意義。由于末端復(fù)制問題，端粒在每個細胞周期S期時都會縮短，當其縮短到臨界長度時，就會導(dǎo)致細胞周期阻滯、細胞衰老及細胞凋亡［14］。Bernadotte等［15］注意到，當外界因素造成DNA雙鏈損傷時也可發(fā)生端粒變短。端粒酶是一種能通過新添加TTAGGG重復(fù)染色體，補償這種端粒損耗的細胞酶，在早期胚胎細胞中大量表達。盡管端粒酶在成人干細胞中也有表達，但其在成人組織中的表達不足以阻止由于端?？s短所引起的機體老化［16］。Donate等［17］應(yīng)用端粒酶基因突變小鼠觀察端粒酶和端粒長度對干細胞的影響，證實端粒酶的確具有抗衰老活性。他們條件性地敲除結(jié)合蛋白端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1（telomere repeat binding factor 1，TRF1）、三肽基肽酶1（tripeptidylpeptidase 1，TPP1）和抑制/激活蛋白1（repressor/activator protein 1，Rap1）構(gòu)建端粒酶功能障礙的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)即使端粒處于正常的長度也足以產(chǎn)生組織早衰、染色體畸變和腫瘤性病變。然而與生殖細胞、干細胞和癌細胞不同的是，大部分正常體細胞的端粒酶水平無法達到最低檢出閾值。因此需要注意的是，端粒酶檢測作為一種有效的判斷細胞衰老的方法，僅適用于對生殖細胞、干細胞和癌細胞的研究，而在正常體細胞的衰老研究中，不宜選其作為衰老標志物。

3 衰老相關(guān)的異染色質(zhì)灶

Narita等［18］在2003年首次提到SAHF。SAHF是一種富含異染色質(zhì)蛋白1γ（heterochromatin protein 1γ，HP1γ）、抗沉默功能蛋白1（antisilencing function 1，ASF1）、組蛋白H3賴氨酸9三甲基化（H3 lysine9 trimethylation，H3K9me3）和磷酸化組蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX，γH2AX）的染色質(zhì)修飾，能夠隔離細胞周期調(diào)控基因，加強與衰老相關(guān)的生長停滯［19］。有研究顯示，在衰老細胞中異染色質(zhì)的丟失導(dǎo)致基因不穩(wěn)定性增加，從而引起DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力的下降［20］。Collado等［21］報道，SAHF可通過抑制與增殖相關(guān)的部分基因蛋白的表達，誘導(dǎo)細胞衰老，并維持穩(wěn)定的衰老狀態(tài)。Kreiling等［22］在培養(yǎng)的老年人成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)，異染色質(zhì)相關(guān)的巨組蛋白H2A（macroH2A）和異染色質(zhì)蛋白1β（heterochro?matin protein 1β）的水平明顯增加。然而Kennedy等［23］檢測并比較了衰老的人胚肺成纖維細胞IMR90和小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）中的SAHF，發(fā)現(xiàn)相對于IMR90，MEF無法形成SAHF以響應(yīng)癌基因Ras的激活以及端粒酶的縮短，即無法使用SAHF標記MEF的衰老現(xiàn)象。盡管檢測某些細胞或組織的SAHF能證實衰老的發(fā)生，但并非在所有種屬的衰老細胞中都可檢測到SAHF，所以SAHF作為一種衰老標志物具有局限性，在研究中不能作為判斷是否發(fā)生衰老的唯一檢測手段，需要結(jié)合其他衰老相關(guān)的檢測方法綜合判斷。

4 衰老相關(guān)的分泌表型

衰老細胞能夠通過自分泌和旁分泌向細胞外環(huán)境分泌不同的分子，包括細胞因子、生長因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等，即SASP［23］。SASP可改變細胞的微環(huán)境，其作用一方面可激活機體的免疫系統(tǒng)清除衰老細胞，另一方面可促進鄰近的受體細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［24-25］。不同種類的衰老細胞分泌的SASP雖然在成分上不盡相同，但都特異性地表達高水平的細胞炎癥因子白細胞介素6（interleu?kin 6，IL-6）和IL-8。Kuilman等［26］通過結(jié)合分析遺傳學(xué)和生物信息學(xué)，并利用人二倍體成纖維細胞體外模型，發(fā)現(xiàn)癌基因誘導(dǎo)的細胞衰老與某些炎癥轉(zhuǎn)錄因子的激活有關(guān)，并證實轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白β能聯(lián)合IL-6增強IL-8的激活，而導(dǎo)致衰老。目前研究報道，IL-6與DNA損傷導(dǎo)致的小鼠和人角質(zhì)形成細胞、黑素細胞、單核細胞、成纖維細胞和上皮細胞的衰老均有關(guān)聯(lián)［27-28］。由于細胞因子IL-6和IL-8等也同時參與包括炎癥反應(yīng)在內(nèi)的多種生理病理過程，所以SASP雖不能作為判斷衰老發(fā)生與否的特異性指標，但在實際研究中可通過結(jié)合其他檢測指標來共同判斷衰老的發(fā)生情況，特別是在研究衰老對細胞或組織微環(huán)境的改變時，研究SASP具有重要的生物學(xué)意義。

5 活性氧簇

現(xiàn)已研究表明，細胞衰老伴隨ROS水平增高，且ROS作為衰老的誘發(fā)機制已被廣泛研究。細胞在某些因素（如癌基因活化、應(yīng)激反應(yīng)和外來化學(xué)物暴露）的誘導(dǎo)下可產(chǎn)生高水平的ROS，導(dǎo)致無法修復(fù)的雙鏈DNA斷裂（double-strand DNA breaks，DSB），而這種DNA損傷的積聚正是衰老細胞的共同特征［29-30］。Maciel-Barón等［31］報道，氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)小鼠肺成纖維細胞早衰。研究發(fā)現(xiàn)，用刺桐酚素處理胰腺癌和乳腺癌細胞能夠促進其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生成大量ROS，最終使細胞周期發(fā)生G1期阻滯而觸發(fā)衰老［32］。Luo等［33］用白藜蘆醇（resveratrol，RV）誘導(dǎo)肺癌細胞衰老，發(fā)現(xiàn)RV能通過上調(diào)NADPH氧化酶-5（NADPH oxidase 5，Nox5）的表達引起DSB與ROS水平的增加。Martinez等［34］發(fā)現(xiàn)，人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncy?tialvirus，HRSV）能夠誘導(dǎo)DNA損傷標志物的表達，并繼發(fā)靶細胞線粒體ROS的生成，導(dǎo)致DNA損傷的積累，最終觸發(fā)靶細胞早衰。雖然在所有的衰老細胞中幾乎都伴隨ROS的大量堆積，但ROS參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及病理生理過程，故ROS水平增高不能作為細胞衰老發(fā)生的標志性事件。ROS作為衰老檢測指標的研究意義主要在于其高度的敏感性。已有研究表明，在衰老誘發(fā)因素作用后僅數(shù)分鐘內(nèi)，細胞中ROS水平便達到高值，進而觸發(fā)其下游一系列的分子事件。故ROS的檢測對衰老相關(guān)分子機制的闡明具有重要的意義。

6 腫瘤抑制基因和蛋白

研究表明，衰老的發(fā)生與腫瘤抑制基因和蛋白P53/P21有關(guān)［35］。P21是細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）抑制劑家族中的重要成員，能夠抑制CDK2而引起G1期細胞周期阻滯。Chakraborty等［36］用刺桐酚素誘導(dǎo)胰腺癌細胞和乳腺癌細胞后發(fā)現(xiàn)，大部分細胞SA-β-gal活性增加，以及形成SAHF，隨著細胞扁平程度和粒度的增加（衰老的特征表型），P21水平也隨之上升；同時CDK2和細胞周期蛋白D1（cyclinD1）含量明顯下降；N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）抑制ROS的形成，降低P21的表達。表明刺桐酚素暴露可通過增加體內(nèi)ROS水平，激活P21，觸發(fā)G1期細胞周期阻滯，誘導(dǎo)衰老的發(fā)生。Johmura等［37］應(yīng)用延時活細胞成像系統(tǒng)分析多種刺激誘導(dǎo)的人成纖維細胞的衰老過程，發(fā)現(xiàn)其在進入永久性細胞周期阻滯前發(fā)生有絲分裂“跳過”（mitosis skip），由P53依賴性的后期促進復(fù)合物/細胞周期體（ana?phase-promoting complex/cyclosome）的激活誘導(dǎo)。然而，在用電離輻射誘導(dǎo)人乳腺癌細胞MCF-7后進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，P53/P21可能并不是一種特異的衰老標志物，因為在細胞凋亡及短暫細胞周期阻滯過程中，其蛋白水平也會發(fā)生改變，而由衰老誘導(dǎo)的P53/P21蛋白水平增加又是細胞凋亡程序失活的一種補償，所以檢測到P53/P21水平增加并不能區(qū)分其具體誘導(dǎo)原因是衰老還是凋亡。雖然在衰老研究中尚不能將P53/P21作為特異性標志物，需結(jié)合其他檢測指標綜合判斷衰老的發(fā)生情況，但P53/P21及其下游基因構(gòu)成一條重要的衰老通路，對其深入研究有助于對衰老機制的探討。

P16作為一種應(yīng)用較為廣泛的衰老標志物，是一種CDK抑制因子。P16能夠阻止成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein）的磷酸化及失活，形成E2F復(fù)合體，從而調(diào)節(jié)細胞周期進程相關(guān)基因的表達。通過檢測衰老細胞中P16的表達表明，與靜止的或終末分化的細胞不同，大部分衰老細胞（如人成纖維細胞、外周血T淋巴細胞和小鼠體細胞等）都能夠表達P16，且其表達水平隨衰老程度的增加而明顯增加［38］。有學(xué)者在研究衰老小鼠模型時發(fā)現(xiàn)，在脂肪、骨骼肌和眼等組織中，P16有助于衰老表型的形成，而敲除p16基因后小鼠發(fā)生了衰老延遲［39］。Burd等［40］將p16基因敲入小鼠體內(nèi)對其進行終身熒光評估（lifelong assessment of lumi?nescence）發(fā)現(xiàn)，所得指數(shù)隨鼠齡的增加而增加，提示P16的表達可能是人類和小鼠組織中較為可信的體內(nèi)衰老標志物。

7 展望

隨著我國人口老齡化高峰的到來，有關(guān)衰老機制及衰老相關(guān)標志物的研究，對于老年病的防治和抗衰老藥物的研究具有重要的科研和現(xiàn)實意義。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境污染物及某些外源性毒物的暴露可使人體的衰老提前發(fā)生。在外源性化學(xué)物致機體衰老的研究中，選擇適當?shù)臋z測指標，明確每種指標的應(yīng)用條件以及各自的優(yōu)勢和劣勢，有利于對衰老分子機制的闡明，從而為進一步的科學(xué)研究提供重要的線索和研究方向。

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Comparison of severalcommon detection indexes of cellsenescence

ZHANG Yi-yuan,XIAO Fang
(Department of Health Toxicology,Xiangya Schoolof Public Health,CentralSouth University, Changsha 410078,China)

Cell senescence is a state of irreversible growth arrest,which can be triggered by a variety of different cellular stress.Currently,the detection indexes involved in the study of cellsenes?cence include senescence-associatedβ-galactosidase,telomeres and telomerase,senescence-associ?ated heterochromatin foci,senescence-associated secretory phenotype,reactive oxygen species,and tumor suppressor genes p53 and p16.These indexes are widely used in the study of cellsenescence, each with its own characteristics or advantages.This review summarizes several common cellsenes?cence indexes and compares theiraccuracy,credibility,specificity,and potentialapplications.

cellsenescence;detection;index

XIAO Fang,Tel:(0731)84805461,E-mail:fangxiao@csu.edu.cn

R965.1

：A

：1000-3002-（2017）04-0352-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.04.009

Foundation item:The project supported by NationalNatural Science Foundation of China(81302456);and Natural Science Foundation of Hunan Province(2015JJ3135)

2016-11-11接受日期：2017-04-07）

（本文編輯：趙楠）

國家自然科學(xué)基金（81302456）；湖南省自然科學(xué)基金（2015JJ3135）

張譯元，女，碩士研究生，主要從事肝臟分子毒理學(xué)研究。

肖芳，E-mail：fangxiao@csu.edu.cn，Tel：（0731）84805461