骨關(guān)節(jié)炎氧化應(yīng)激及干預(yù)的研究進(jìn)展

周巧+劉健

【摘 要】 骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的漸進(jìn)性疾病，影響所有關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，包括軟骨、軟骨下骨、關(guān)節(jié)滑膜及其相鄰的支持結(jié)締組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。近年來越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激即自由基清除機(jī)制的失衡是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制，氧化應(yīng)激不僅導(dǎo)致軟骨破壞，同時(shí)參與炎癥介質(zhì)的分泌和降解過程，促進(jìn)從臨床無癥狀的軟骨破壞到明顯骨關(guān)節(jié)炎的過渡。中醫(yī)藥在抗氧化方面有顯著成效，故對(duì)氧化應(yīng)激在骨關(guān)節(jié)炎中研究現(xiàn)狀及中藥干預(yù)進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；氧化應(yīng)激；活性氧；活性氮；中藥干預(yù)；綜述

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性疾病，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受損，呈高齡化增長。氧化應(yīng)激（OS）是指機(jī)體受各種有害刺激時(shí)產(chǎn)生過多的自由基、活性氧（ROS）或活性氮（RNS）和（或）機(jī)體抗氧化能力減弱，機(jī)體自身對(duì)ROS或RNS清除不足，導(dǎo)致體內(nèi)ROS或RNS增多，破壞了機(jī)體原來的氧化/還原的平衡狀態(tài)，OA中OS則致局部關(guān)節(jié)內(nèi)病變和滑膜炎癥，影響軟骨細(xì)胞的合成代謝過程，導(dǎo)致軟骨退化，是OA發(fā)病的重要機(jī)

制[1]。ROS或RNS直接或間接破壞軟骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（主要成分是膠原和蛋白聚糖），其中氨基酸的氧化修飾、亞硝基化、硝化和氯化都可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而損害其生物功能，以及線粒體DNA損害，影響軟骨細(xì)胞合成代謝，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞衰老和凋亡[2]。Yudoh等[3]發(fā)現(xiàn)，在OA關(guān)節(jié)軟骨中，OS的存在導(dǎo)致端?；蚪M不穩(wěn)定，致軟骨細(xì)胞衰老和調(diào)亡。中醫(yī)藥治療OA療效確切，通過清除自由基、抗氧化及抑制炎癥介質(zhì)等保護(hù)軟骨細(xì)胞延緩病情發(fā)展。本文就近年來OS在OA中的發(fā)展及中藥干預(yù)方面進(jìn)展做一綜述。

1 OS概述

1.1 定 義 ROS是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，其產(chǎn)生主要是線粒體由狀態(tài)Ⅲ向狀態(tài)Ⅳ轉(zhuǎn)換中高氧的環(huán)境和高還原態(tài)的呼吸鏈?zhǔn)勾罅侩娮勇┏霾⑦€原氧分子而形成。很多證據(jù)提示，在促凋亡信號(hào)作用下，ROS的升高可能作為第二信使上調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)，促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放，激活天冬氨酸特異的半胱氨基酸酶，參與Ca2+途徑等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在OA中，OS可以使細(xì)胞膜和核酸以及外成分包括蛋白多糖和膠原蛋白發(fā)生降解，還可致線粒體損傷包括線粒體DNA功能紊亂、抗氧化系統(tǒng)防御失調(diào)、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、線粒體的細(xì)胞骨架破壞等，造成軟骨老化和退化[4-5]。

1.2 生物標(biāo)志物 OS可影響OA進(jìn)程，因此需要發(fā)現(xiàn)總結(jié)臨床相關(guān)的生物標(biāo)記物，能夠判斷疾病發(fā)展進(jìn)程及預(yù)后。OA患者中ROS相關(guān)標(biāo)志物水平顯著升高已在既往文獻(xiàn)被觀察到[6]。自由基主要氧化損傷DNA、脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)等大生物分子。DNA的測量值可以反映全身OS累積水平，主要的尿生物標(biāo)記物有8-氧代-2'-脫氧鳥苷和8-氧鳥苷。對(duì)于脂質(zhì)的氧化損傷主要有3個(gè)指標(biāo)：血清中丙二醛（MDA），例如4-羥基-2-壬醇（4-HNE）可直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的水平，硒谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），尿液或血漿中F2-異前列腺（F2-IsoPs）反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化水平。蛋白質(zhì)的氧化損傷主要有2個(gè)指標(biāo)：蛋白羰基生成（羰基化）和二酪氨酸的生成（蛋白質(zhì)中酪氨酸硝基化）。

1.3 抗氧化系統(tǒng) 機(jī)體內(nèi)自身存在管理系統(tǒng)維持氧化還原平衡，它們能保持ROS生產(chǎn)和代謝之間的平衡，并保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。消除ROS的抗氧化防御體系分為酶系和非酶系，前者有谷胱甘肽、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）、γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰（GSH）等；后者主要有還原性谷胱甘肽和一些小分子物質(zhì)，例如維生素C、維生素E、維生素D3和煙酸或維生素B3的酰胺形式。此外，某些蛋白質(zhì)（鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、銅藍(lán)蛋白）作為抗氧化劑，可以結(jié)合和封存過渡金屬開始氧化反應(yīng)。此外，血紅素加氧酶-1（HO-1）是血紅素代謝的限速酶，被認(rèn)為能夠降低OS和抑制炎癥的抗氧化劑酶。

2 OS與OA的基礎(chǔ)研究

Suantawee等[7]將35例OA患者和35例健康對(duì)照者作為研究對(duì)象，通過測定血漿和滑液中亞硝酸鹽、MDA、維生素E的水平，以及鐵離子還原抗氧化能力（FRAP），比較2組的抗氧化能力（TEAC）。結(jié)果OA患者的滑液中維生素E水平明顯高于配對(duì)的血漿樣本，總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)組均較正常對(duì)照組顯著降低，表明OS可能是OA發(fā)病的主要機(jī)制。王桂珍等[8]對(duì)40例膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）患者血清SOD進(jìn)行分析，結(jié)果血清SOD值低于正常參考值的例數(shù)及所占百分比為90%，表明SOD與KOA病情活動(dòng)性密切相關(guān)。自由基對(duì)軟骨的損傷機(jī)制較為復(fù)雜，目前研究表明，OS可致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)、軟骨細(xì)胞和線粒體損傷，可能是OA的重要機(jī)制。Loeser等[9]

從正常人體關(guān)節(jié)軟骨分離出軟骨細(xì)胞在海藻酸珠中培養(yǎng)，OS由叔丁基過氧化氫（TBHP）誘導(dǎo)，免疫印跡分析細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，共焦顯微鏡用來測量核Smad4的易位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OS通過抑制胰島素樣生長因子-1（IGF-1）刺激蛋白激酶磷酸化，減少成骨蛋白-1（OP-1）刺激Smad4的核易位，抑制IGF-1和OP-1刺激蛋白多糖合成。Yin等[10]也通過對(duì)正常和OA患者細(xì)胞中IGF-1信號(hào)通路進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OA軟骨細(xì)胞升高的ROS通過影響AKt與ERK通路的平衡而致軟骨細(xì)胞IGF-1抵抗，致軟骨細(xì)胞合成減少。Bhatti等[11]發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑維生素E可以增加體外過氧化氫誘導(dǎo)的鼠軟骨細(xì)胞中蛋白多糖含量，降低亞硝酸鹽含量，同時(shí)提高軟骨細(xì)胞的存活率。Grishko等[4]發(fā)現(xiàn)，OA軟骨細(xì)胞中存在線粒體DNA的損傷，OS后線粒體DNA修復(fù)能力下降，細(xì)胞活力降低，軟骨細(xì)胞凋亡增加，證實(shí)了由OS引起的線粒體DNA損傷及修復(fù)能力下降可能導(dǎo)致OA的發(fā)展。近年的研究普遍認(rèn)為，酶類和細(xì)胞因子在OA的發(fā)病中起著重要作用，酶類的降解失調(diào)、體內(nèi)抗炎因子與促炎因子之間的平衡被打破，可致胞外基質(zhì)的降解和軟骨的破壞。而高水平的氧自由基與免疫和炎癥密切相關(guān)，如關(guān)節(jié)滑液中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、炎性滑膜等均可釋放過量氧自由基，從而加速OA的發(fā)生發(fā)展。Martin等[12]發(fā)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-1β可以激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，并通過活化激活蛋白-1（AP-1）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的途徑誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）

和MMP-13的合成和分泌，導(dǎo)致基質(zhì)降解損傷軟骨細(xì)胞。NADPH氧化酶（NOX）是ROS的主要酶體。Rousset等[13]發(fā)現(xiàn)，HO-1表達(dá)能抑制NADPH氧化酶4的活性，從而減少M(fèi)MP-1的分泌，減少軟骨細(xì)胞死亡。

自噬是在OS條件下控制細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制。既往研究發(fā)現(xiàn)，自噬可能通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平間接減少細(xì)胞器的損傷進(jìn)而起到削弱凋亡的作用[14]。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)OXO蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子激活自噬蛋白質(zhì)如LC3和Beclin1基因以調(diào)節(jié)自

噬[15]。Akasak等[16]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)FOXO轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)將會(huì)增加OS，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞調(diào)亡，可能與抗氧化劑和自噬相關(guān)蛋白（LC3和Beclin1基因水平）減少有關(guān)?？筄S細(xì)胞保護(hù)機(jī)制包括通過轉(zhuǎn)錄因子如核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的轉(zhuǎn)錄控制細(xì)胞保護(hù)酶。

3 中藥干預(yù)OS

程園園等[17]觀察新風(fēng)膠囊（主要成分為黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等）對(duì)KOA患者B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA）及SOD變化的影響，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BTLA表達(dá)頻率及活化水平，比色法測定血清SOD，酶聯(lián)免疫吸附法檢測2組血清中IL-10、IL-1β、MDA，結(jié)果新風(fēng)膠囊能提高KOA患者外周血BTLA表達(dá)，抑制T細(xì)胞活化，降低異常免疫反應(yīng)和OS損傷。賴震等[18]

觀察海桐皮湯熏蒸對(duì)兔KOA氧自由基代謝的影響，分組造模后4周檢測實(shí)驗(yàn)前后兔血清SOD活性和MDA含量，結(jié)果2組比較，模型組治療后SOD活性降低，MDA含量升高，實(shí)驗(yàn)組SOD活性升高，MDA含量降低，表明海桐皮湯熏蒸可在一定程度上降低OA氧自由基含量，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變，促進(jìn)軟骨修復(fù)。李振華等[19]研究鹿茸多肽對(duì)OA軟骨細(xì)胞的氧化損傷的逆轉(zhuǎn)作用，對(duì)15只日本兔造模后體外分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，

8周后用DCFH-DA法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，Griess法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO、SOD和GSH-Px含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一定濃度的鹿茸多肽顯著提高兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD和GSH-Px水平。傅強(qiáng)等[20]運(yùn)用骨刺消合劑（熟地黃、黃芪、補(bǔ)骨脂、威靈仙等）治療KOA患者60例，結(jié)果骨刺消合劑組患者血清中SOD含量上升，NO和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量下降。李建斌等[21]將76例KOA患者隨機(jī)分組，治療組口服仙靈骨葆膠囊（主要成分為淫羊藿、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、地黃、丹參、知母等），對(duì)照組口服雙氯芬酸鈉，觀察治療前后膝關(guān)節(jié)液中NO、SOD和MDA的含量，結(jié)果治療組用藥8周后血漿中SOD活性明顯提高，MDA含量和NO活性比治療前顯著下降。Kim等[22]研究人參皂苷Rb如何調(diào)節(jié)軟骨基因及促炎因子達(dá)到軟骨保護(hù)作用，培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分別用

100 μM的人參皂苷Rb1和（或）500 μM的過氧化氫（H2O2），并評(píng)估存活率，ROS、NO水平和軟骨基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1減少IL-1β和TNF-α的釋放，促進(jìn)軟骨基因如Ⅱ型膠原和SOX9的表達(dá)，抑制MMP-1、MMP-13，以及NO和細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。張沖等[23]觀察補(bǔ)腎固筋方對(duì)KOA患者IL-1、iNOS水平的影響，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1、iNOS的含量，結(jié)果治療后中藥組（口服補(bǔ)腎固筋方）和對(duì)照組（口服美洛昔康膠囊）IL-1、iNOS水平較治療前均增高；中藥組關(guān)節(jié)液和血清IL-1、iNOS相比，對(duì)照組顯著降低。提示中藥補(bǔ)腎固筋方通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)水平來調(diào)控細(xì)胞凋亡和減輕軟骨破壞，改善KOA發(fā)生及發(fā)展。

4 小 結(jié)

綜上所述，OS在OA中發(fā)揮重要作用，ROS的產(chǎn)生和清除平衡失調(diào)、氧化和抗氧化的失衡均可導(dǎo)致相關(guān)的生物大分子及軟骨損傷，繼而導(dǎo)致疾病的發(fā)生和進(jìn)展。積聚的ROS或RNS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞衰老和凋亡，并損害其功能，破壞軟骨的結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的功能障礙。對(duì)OS與OA關(guān)系的研究可加深對(duì)OA發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為臨床正確使用藥物及研究新藥提供指導(dǎo)及思路。同時(shí)中藥及其有效活性成分在清除自由基方面具有較大的優(yōu)勢和潛力，許多化學(xué)成分如黃酮類、三萜類等都已經(jīng)在清除自由基方面顯示出較好的活性[24]。

OS影響軟骨和軟骨下骨代謝是非常復(fù)雜的；但目前對(duì)如何維持軟骨細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)及其相關(guān)機(jī)制和通路卻知之甚少，需要更多的研究闡明OS、軟骨和OA之間的復(fù)雜關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)氧化和抗氧化平衡的方法及途徑，從而減少自由基所致的OA軟骨組織的損傷。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)中藥調(diào)控OA軟骨細(xì)胞凋亡的理論和臨床研究，從多角度、多層次深入揭示中醫(yī)藥發(fā)揮藥效作用靶點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制，為臨床上OA治療提供新方法和思路。

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收稿日期：2016-07-15；修回日期：2016-08-29