桑黃水提物抑菌作用的研究與應(yīng)用

王欽博，楊 焱，齊曉彥

（1乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司，上海 200436；2農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海 201403）

桑黃水提物抑菌作用的研究與應(yīng)用

王欽博1，楊 焱2，齊曉彥1

（1乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司，上海 200436；2農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海 201403）

桑黃（Phellinus baumii.）是一種食藥用真菌，利用沸水可提取其子實(shí)體抑菌成分。通過(guò)選取乳制品中常見(jiàn)的、具有代表性的有害指示菌，研究了不同濃度的桑黃水提物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌，霉菌和酵母的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)：桑黃水提物在1—10 mg/mL作用濃度下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛乳中有害細(xì)菌、真菌有效的抑制，能顯著控制巴殺牛乳中菌群總數(shù)的變化，同時(shí)對(duì)有益菌無(wú)顯著影響，相對(duì)Nisin等抑菌劑具有廣譜抑菌性。

抑菌；桑黃；霉菌；酵母；細(xì)菌

隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的不斷提高，我國(guó)乳品行業(yè)已步入了快速發(fā)展時(shí)期，消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)乳制品的品質(zhì)要求也在不斷提高。開(kāi)發(fā)針對(duì)不同消費(fèi)人群的、具有特殊生理功能的高品質(zhì)乳制品成為我國(guó)乳業(yè)發(fā)展的一個(gè)新方向。而目前國(guó)內(nèi)外乳品微生物污染事故頻發(fā)，如2000年日本雪印旗下三款產(chǎn)品檢出金黃色葡萄球菌超標(biāo)，2002年美國(guó)惠氏生產(chǎn)的乳粉被檢出阪崎桿菌超標(biāo)等［1］。由于乳制品中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、乳糖、維生素等，在乳制品的生產(chǎn)流通以及儲(chǔ)存過(guò)程容易受到微生物的污染。因而，抑菌問(wèn)題成為開(kāi)發(fā)特色高品質(zhì)乳制品重要的環(huán)節(jié)之一。

乳制品的抑菌方式主要有內(nèi)源成分抑菌和外源物質(zhì)添加抑菌［2］。如目前研究最深、應(yīng)用最廣的是乳酸鏈球菌肽（Nisin），Nisin能有效地控制食品中的有害細(xì)菌［3］，特別是耐熱的芽孢桿菌及梭菌的生長(zhǎng)和繁殖，以達(dá)到延長(zhǎng)不同乳制品貨架期的目的。Nisin能夠有效控制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)繁殖，但對(duì)革蘭氏陰性菌、酵母以及霉菌不具有抑制作用［4-5］。因而，與乳制品內(nèi)源性抑菌物質(zhì)相比，外源添加抑菌成分有作用范圍小、不具廣譜抑菌性的弊端。開(kāi)發(fā)一種天然、安全的外源抑菌成分應(yīng)用于乳制品的抑菌具有重要的意義。

桑黃（Phellinus spp.）作為一種珍貴的傳統(tǒng)食藥用真菌，是國(guó)際認(rèn)同的食品領(lǐng)域中相率最高的一種食藥用真菌［6-7］。目前，對(duì)于桑黃子實(shí)體水提物的生物活性有諸多報(bào)道，如抗氧化［8］、抗腫瘤［9］、抗衰老、提高免疫力、抗纖維化、抗肺炎［10-13］等功效。本研究通過(guò)研究桑黃子實(shí)體水提物的抑菌性，并應(yīng)用于乳制品，考察桑黃子實(shí)體水提物對(duì)保鮮乳中菌群總數(shù)的影響，旨在為開(kāi)發(fā)一種天然、安全、性能佳的乳制品抑菌劑做部分基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1．1 原料與儀器

PDA培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，按藥品說(shuō)明取固體粉末加去離子水溶解后，121℃滅菌15 min后，待用；MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基購(gòu)于德國(guó)默克公司，按藥品說(shuō)明取固體粉末溶解后，121℃滅菌15 min后，待用；指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、宋內(nèi)氏志賀氏菌（Shigella Castellani）、沙門(mén)氏菌（Salmonella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium candidum）、白霉（Geotrichum candidum）、酵母菌種（Saccharomyces cerevisiae）保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）以及雙歧桿菌（Bifidobacterium），以上菌種保存于光明乳業(yè)股份有限公司菌種庫(kù)；桑黃（Phellinus baumii.）保存于中國(guó)微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心。

Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，購(gòu)于芬蘭Bioscreen公司；高壓蒸汽滅菌鍋HVE-50，購(gòu)于HIRAYAMA公司；超凈工作臺(tái)TH-CB-402，購(gòu)于LABCONCO公司。

1．2 桑黃水提物的制備

將桑黃菌種栽培得到子實(shí)體后，將子實(shí)體粉碎至約1 cm3的顆粒，在干燥的子實(shí)體粉碎物中加入20倍體積的去離子水，沸水提取2 h，濾得殘?jiān)M(jìn)行二次提取；合并兩次提取液并進(jìn)行濃縮，4 000 r/min離心10 min去除沉淀；將乙醇加入濃縮液中，至乙醇終濃度為90%，室溫下靜置24 h后，將離心后沉淀部分加去離子水溶解，再次離心去除不溶物質(zhì)；將上清進(jìn)行透析12 h，透析后溶液進(jìn)行冷凍干燥，即得桑黃水溶性提取物，115℃滅菌15 min后使用。

1．3 革蘭氏陰性菌抑制試驗(yàn)

抑菌方法參照Z(yǔ)HAO［14］并稍作改動(dòng)。取桑黃水提物分別用無(wú)菌去離子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取大腸桿菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、沙門(mén)氏菌分別進(jìn)行菌種復(fù)蘇后，將菌體接種于液體肉湯培養(yǎng)基37℃下振蕩培養(yǎng)18 h，調(diào)節(jié)培養(yǎng)后菌液中菌種濃度為105—106個(gè)/mL，取1 mL調(diào)節(jié)后菌液與呈液態(tài)的肉湯瓊脂培養(yǎng)基混合均勻后倒至培養(yǎng)皿中；待培養(yǎng)基凝固后，將20 μL不同濃度桑黃水提物溶液滴在混有有害微生物的固體培養(yǎng)基上，以20 μL無(wú)菌水作為對(duì)照組；37℃下靜置培養(yǎng)48 h后測(cè)量平板抑菌圈大小。

1．4 革蘭氏陽(yáng)性菌抑制試驗(yàn)

抑菌方法參照Z(yǔ)HAO［14］并稍作改動(dòng)。取桑黃水提物分別用無(wú)菌去離子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌以及枯草芽孢桿菌分別進(jìn)行菌種復(fù)蘇，其余步驟參照“1.3革蘭氏陰性菌抑制試驗(yàn)”。

1．5 霉菌抑制試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)［15］的方法，并略做改動(dòng)。將滅菌后桑黃水提物與PDA培養(yǎng)基混合均勻，使桑黃水提物終濃度為0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL，倒入平板凝固后，以空白PDA固體培養(yǎng)基為對(duì)照；取青霉、白霉菌株分別進(jìn)行活化并進(jìn)行固體擴(kuò)大培養(yǎng)，7 d后分別挑取青霉、白霉菌種于平板中心，30℃培養(yǎng)7 d后，分別測(cè)量青霉、白霉在平板中的直徑。

1．6 酵母生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

取啤酒酵母菌種進(jìn)行復(fù)活，挑取活化后的釀酒酵母擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)節(jié)酵母菌體濃度為105—106個(gè)/mL并取180 μL酵母發(fā)酵液與20 μL桑黃水提物溶液均勻混合，置于Bioscreen10×10孔板，使樣品終濃度分別為4 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，30℃連續(xù)震蕩，寬波長(zhǎng)于600 nm吸光度，間隔20 min讀數(shù)，連續(xù)測(cè)定2 000 min。

1．7 巴氏殺菌乳菌群總數(shù)的控制

將滅菌后的桑黃水提物與新鮮牛乳混合均勻，使樣品在牛乳中的終濃度為0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL，均質(zhì)后進(jìn)行巴氏殺菌，置于10℃下保存，按國(guó)標(biāo)“GB 47892—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)”方法測(cè)定牛乳中細(xì)菌總數(shù)，連續(xù)測(cè)定2周。

1．8 有益菌的影響

抑菌方法參照Z(yǔ)HAO［14］并稍作改動(dòng)。取桑黃水提物分別用無(wú)菌去離子水配制成1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取保加利亞乳桿菌（MRS培養(yǎng)基）、嗜熱鏈球菌（M17培養(yǎng)基）以及雙歧桿菌（MRS培養(yǎng)基）三種有益菌株復(fù)蘇擴(kuò)大培養(yǎng)，其余步驟參照“1.3革蘭氏陰性菌抑制試驗(yàn)”。

2 結(jié)果與分析

2．1 革蘭氏陰性菌的抑制結(jié)果

抑菌圈大小可反映抑菌保護(hù)劑抑菌能力，抑菌圈越大，抑菌能力越強(qiáng)（表1）。當(dāng)不同濃度桑黃水提物作用下，混有有害微生物的平板出現(xiàn)抑菌圈，且抑菌圈隨樣品作用濃度的升高，直徑也不斷擴(kuò)大；桑黃水提物對(duì)志賀氏菌抑制作用較弱，對(duì)于大腸桿菌的抑制較為明顯，在1 mg/mL作用濃度下，即對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。由此可得出結(jié)論，桑黃水提物能有效抑制革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)，但對(duì)不同細(xì)菌抑制程度有所不同。

表1 不同濃度桑黃水提物對(duì)陰性菌的抑制Table 1 The inhibition of gram-negative bacteria after adding aqueous extracts

2．2 革蘭氏陰性菌的抑制結(jié)果

不同濃度桑黃水提物作用下，混有有害微生物金黃色葡萄球菌、李斯特菌、藤黃微球菌以及枯草芽孢桿菌的平板均可以觀察到抑菌圈。抑菌作用具有樣品濃度依賴(lài)性，隨樣品濃度的升高，抑制作用加強(qiáng)。樣品在低濃度范圍對(duì)藤黃微球菌作用不明顯；相對(duì)樣品對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑制作用較為顯著。

表2 不同濃度桑黃水提物對(duì)陽(yáng)性菌的抑制Table 2 The inhibition of gram-positive bacteria after adding aqueous extracts

2．3 霉菌生長(zhǎng)抑制情況

將不同濃度桑黃水提物混入PDA固體培養(yǎng)基，將白霉、青霉菌落置于平板中心，對(duì)霉菌生長(zhǎng)的抑制作用與霉菌生長(zhǎng)圈直徑大小呈負(fù)相關(guān)（表3）。樣品作用下，霉菌生長(zhǎng)圈直徑相對(duì)于空白對(duì)照縮小，且霉菌生長(zhǎng)圈直徑隨著作用劑濃度增大而縮小。10 mg/mL作用濃度下，生長(zhǎng)圈直徑分別為空白對(duì)照直徑的16.2%、40.6%，因而樣品可有效抑制霉菌的生長(zhǎng)。

2．4 酵母生長(zhǎng)抑制情況

酵母等微生物在培養(yǎng)液中繁殖都能產(chǎn)生濁度。利用Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定酵母生長(zhǎng)過(guò)程中吸光值的改變，反映其生長(zhǎng)速度及菌體濃度等。從圖1可以看出，在桑黃水提物的作用下，對(duì)酵母的生長(zhǎng)出現(xiàn)了抑制作用，且隨作用濃度的升高，最大吸光值越小，酵母生長(zhǎng)周期最高菌體濃度越低。

表3 不同濃度桑黃水提物對(duì)霉菌生長(zhǎng)的抑制作用Table 3 Different concentrations of aqueous extracts of inhibition for the growth of mold

2．5 巴殺保鮮乳中菌群生長(zhǎng)抑制情況

隨著桑黃水提物濃度的提高，保存相同時(shí)間的保鮮牛奶乳中菌群總數(shù)越低，10 mg/mL作用濃度下，10℃保存14 d的巴殺鮮乳菌群總數(shù)最高未超過(guò)2×104cfu/mL?？梢?jiàn)，桑黃水提物能有效控制保鮮牛奶乳中菌群總數(shù)，起到延長(zhǎng)貨架期的作用。

圖1 不同濃度桑黃水提物對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制作用Fig．1 Different concentrations of aqueous extracts of inhibition for the growth of yeast

圖2 不同濃度桑黃水提物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用Fig．2 Different concentrations of aqueous extracts of inhibition for the growth of bacteria

2．6 有益菌生長(zhǎng)作用情況

選取乳制品中常見(jiàn)有益菌進(jìn)行試驗(yàn)，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌并沒(méi)有產(chǎn)生可見(jiàn)的抑菌圈，只有在濃度較高時(shí)才在雙歧桿菌平板上觀察到較小的抑菌圈（表4），所以本發(fā)明的抑菌保護(hù)劑對(duì)有益菌無(wú)顯著抑制作用。

表4 桑黃水提物對(duì)有益菌的作用Table 4 The influence of different concentration aqueous extracts of probiotics

3 結(jié)論與討論

由于不同乳制品中成分較為復(fù)雜，添加菌種類(lèi)別、奶源成分比例、加工方式、生產(chǎn)設(shè)備等均存在差異，因此很難用統(tǒng)一的抑菌方法應(yīng)用到乳品企業(yè)生產(chǎn)中。目前多數(shù)乳品企業(yè)通過(guò)改變生產(chǎn)工藝、提高原奶的品質(zhì)來(lái)達(dá)到延長(zhǎng)貨架期的目的，現(xiàn)有澳大利亞乳企將巴氏殺菌乳從原有21 d保質(zhì)期，通過(guò)生產(chǎn)工藝改造將貨架期延長(zhǎng)至45 d。另有乳企通過(guò)添加天然、安全的抑菌成分的方式，延長(zhǎng)保鮮乳制品的貨架期，但目前食品標(biāo)準(zhǔn)允許添加的抑菌成分較少，且不具有廣譜抑菌性。應(yīng)當(dāng)尋求多種保鮮技術(shù)的協(xié)同作用的方式，以達(dá)到抑制乳制品中有害微生物生長(zhǎng)的目的。

本試驗(yàn)以食藥用真菌桑黃（Phellinus baumii.）子實(shí)體為研究對(duì)象，使用沸水提取的方法，提取子實(shí)體中具有抑菌性的物質(zhì)。研究分析了該水提物抑菌特性，分別選取了乳制品中具有代表性常見(jiàn)的幾類(lèi)微生物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。桑黃子實(shí)體水提物對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、霉菌以及酵母均有不同程度的抑制作用。對(duì)大腸桿菌等革蘭氏陰性菌，在1 mg/mL作用濃度時(shí)表現(xiàn)出了抑菌性質(zhì)，但對(duì)志賀氏菌作用不明顯；對(duì)于金黃色葡萄球菌等陽(yáng)性菌，抑制效果較佳，在較低濃度0.5 mg/mL作用濃度下，即對(duì)部分陽(yáng)性菌表現(xiàn)抑菌活性。酵母、霉菌是乳制品生產(chǎn)、運(yùn)輸、存放方程中，常見(jiàn)微生物污染源，本研究中考察了在桑黃水提物不同作用濃度下，有效抑制了酵母和霉菌的生長(zhǎng)，一定程度上延長(zhǎng)了保鮮牛乳的貨架期。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，桑黃水提物對(duì)牛乳中有益菌的影響除在50 mg/mL高濃度作用下，對(duì)雙歧桿菌出現(xiàn)輕微抑制現(xiàn)象，但對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌不存在顯著抑制作用。因此，1—10 mg/mL桑黃水提物在不抑制有益菌生長(zhǎng)的前提下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛乳中有害細(xì)菌、真菌有效的抑制，能顯著控制巴殺牛乳中菌群總數(shù)的變化，相對(duì)Nisin等抑菌劑具有廣譜抑菌性。

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（責(zé)任編輯：張睿）

Study and application of aqueous extract from Phellinus baumii on antibacterial activities

WANG Qin-bo1，YANG Yan2，QI Xiao-yan1（1State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Bright Dairy＆Food Co.，Ltd，Shanghai 200436，China；2National Engineering Research Center of Edible Fungi，Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

Phellinus sp.is a highly-valued medicinal mushroom.Antimicrobial constituents were extracted through the boiling water.The typical harmful indicators bacteria existed in dairy products were selected.The different concentrations of the sample were studied in the bacteriostatic action of bacteria，yeast and mildew.The results showed that the Phellinus baumii aqueous extracts restrained the growth of harmful bacteria，mold and yeast in milk effectively under the 1—10 mg/mL concentrations.The total numbers of bacteria in milk were effectively controlled.At the same time there was no harm to the beneficial bacteria，the sample has a broad spectrum antimicrobial resistance compared with Nisin.

Phellinus baumii；Antibacterial activity；Yeast；Mildew；Bacterium

S567.3

A

1000-3924（2016）06-064-05

2015-12-01

十二五科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD28B07）新型乳制品的研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化示范

王欽博（1984—），男，碩士，工程師，從事乳制品發(fā)酵劑及活性研究。E-mail：wangqinbo524＠163.com