外源NO供體SNP對(duì)鹽脅迫下苜蓿葉片POD活性的影響

李易興

（蘭州市漁業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 蘭州 730000）

外源NO供體SNP對(duì)鹽脅迫下苜蓿葉片POD活性的影響

李易興

（蘭州市漁業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 蘭州 730000）

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)鹽脅迫下苜蓿幼苗葉片分別噴施不同濃度的一氧化氮（NO）供體SNP，研究了SNP對(duì)100mmol/L NaCl脅迫下苜蓿幼苗葉片POD活性的影響。結(jié)果表明，0.5mmol/L和1.0mmol/LSNP能提高在長(zhǎng)時(shí)間100mmol/L NaCl脅迫下苜蓿幼苗葉片POD活性，其通過(guò)減輕細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，維持質(zhì)膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而減小損傷程度，對(duì)損傷具有較好的緩解作用；0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的SNP對(duì)POD活性影響不明顯，無(wú)明顯緩解效果。說(shuō)明SNP對(duì)POD活性的調(diào)節(jié)和植物的保護(hù)作用與SNP自身濃度相關(guān)，同時(shí)，SNP不僅可以通過(guò)調(diào)節(jié)POD活性增強(qiáng)苜?？寡趸芰?，而且能通過(guò)調(diào)節(jié)其他保護(hù)酶類起到對(duì)苜蓿的保護(hù)作用，緩解鹽脅迫造成的傷害。

SNP；鹽脅迫；苜蓿葉片；POD

紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生豆科牧草，在我國(guó)的農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中，大力發(fā)展飼料植物應(yīng)首推苜蓿。因其具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，是家畜的優(yōu)良飼草，也是良好的水土保持植物，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位。但因環(huán)境條件的影響，苜蓿在生長(zhǎng)期內(nèi)備受鹽堿土壤的脅迫，我國(guó)大面積的鹽堿地使苜蓿產(chǎn)業(yè)化面臨著如何利用鹽堿土資源合理開(kāi)發(fā)的問(wèn)題。因此，選擇耐鹽堿的苜蓿品種進(jìn)行土地改良，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)又兼顧生態(tài)效益和社會(huì)效益，最終產(chǎn)生出適應(yīng)性好的苜蓿品種成為苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必要保證。通過(guò)對(duì)苜蓿鹽害或耐鹽機(jī)理的研究，利用化學(xué)調(diào)控手段是提高苜蓿耐鹽性的有效措施之一。

植物遭受逆境脅迫傷害的重要特征之一是活性氧代謝失調(diào)，根據(jù)McCord和Fridovich（1969）提出的生物自由基傷害學(xué)說(shuō)，在鹽漬、干旱等逆境條件下，植物體內(nèi)自由基增加，導(dǎo)致脂類發(fā)生過(guò)氧化，破壞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，使植物細(xì)胞不能維持其高度有序的結(jié)構(gòu)而受傷死亡[1]。植物在長(zhǎng)期的抗逆過(guò)程中形成了自身的保護(hù)系統(tǒng)，其中，廣泛存在于植物體中的過(guò)氧化物酶POD是活性較高的一種酶，它能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過(guò)氧化物酶的活性增加，所以過(guò)氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標(biāo)。同時(shí)，過(guò)氧化物酶POD作為內(nèi)源保護(hù)系統(tǒng)中的保護(hù)酶，是植物內(nèi)源自由基消除劑，它通過(guò)增強(qiáng)或保持自身較高水平的酶活性，使逆境中的植物減輕自由基傷害[2]。

據(jù)研究，一氧化氮（NO）是近幾十年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，可使植物的抗逆性有所增強(qiáng)。其對(duì)植物具有雙重性作用——保護(hù)細(xì)胞或毒害細(xì)胞，當(dāng)NO處于較低濃度時(shí)對(duì)植物細(xì)胞具保護(hù)作用，當(dāng)濃度較高時(shí)可能造成對(duì)細(xì)胞的毒害[3]。

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定在鹽脅迫下外源一氧化氮供體（SNP）對(duì)苜蓿幼苗葉片POD活性影響，分析不同濃度SNP與植物POD活性的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步提高苜蓿的耐鹽性、選育優(yōu)良品系和飼草生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為紫花苜蓿。

1.2 方法

1.2.1 土壤滅菌、播種及移栽育苗 將育苗所用土壤拌入有機(jī)肥料于高壓滅菌鍋25℃滅菌2h，將苜蓿種子均勻地播撒入滅菌后的土壤，用塑料薄膜覆蓋保濕，并置于自然光下培養(yǎng)。期間及時(shí)澆水，保持土壤濕度。待生長(zhǎng)出子葉后，揭去薄膜于自然光下培養(yǎng)。在長(zhǎng)出3～4片真葉時(shí)移栽入花盆，于自然光下培養(yǎng)育苗，適時(shí)澆水。

1.2.2 供試材料處理 移栽苜蓿幼苗后，待植株生長(zhǎng)至8～9幼小葉片，選取生長(zhǎng)較一致的植株即可進(jìn)行處理。首先用不同濃度NO供體硝普鈉50 mL進(jìn)行葉面噴施，36 h后分別用100 mL含100 mmol/L的NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理，同時(shí)在溶液中加入不同濃度NO供體硝普鈉，連續(xù)處理3d。設(shè)6種試驗(yàn)處理：CK，用蒸餾水噴施；N，100 mmol/LNaCl脅迫處理；0.1s，含100mmol/LNaCl和0.1 mmol/LSNP溶液；0.2s，含100mmol/LNaCl和0.2mmol /L SNP溶液；0.5 s，含100 mmol/L NaCl和0.5 mmol/L SNP溶液；1.0s，含100 mmol/LNaCl和1.0 mmol/LSNP溶液。每種處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理1d、2d、3d以及恢復(fù)生長(zhǎng)第3天分別取樣進(jìn)行POD酶活性測(cè)定。

1.2.3 過(guò)氧化物酶POD的測(cè)定

1.2.3.1 測(cè)定原理 過(guò)氧化物酶廣泛存在于植物的各個(gè)組織器官中。在有過(guò)氧化氫存在的條件下，過(guò)氧化物酶能催化過(guò)氧化氫氧化酚類，產(chǎn)物為醌類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合或與其他分子縮合，產(chǎn)生顏色較深的化合物。本實(shí)驗(yàn)是以鄰甲氧基苯酚（即愈創(chuàng)木酚）為過(guò)氧化物酶的底物，在該酶存在下，H2O2可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚，該紅棕色的物質(zhì)在波長(zhǎng)470 nm處有最大光吸收，故可通過(guò)測(cè)470 nm處的吸光度變化來(lái)測(cè)定過(guò)氧化物酶POD的活性。

1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器 研缽；100 mL燒杯；冷凍離心機(jī)；電子天平；電熱恒溫水浴鍋；分光光度計(jì)等。

1.2.3.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑 50 mmol/L pH7.8的磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；愈創(chuàng)木酚；30%H2O2；50 mmol/LpH6.0的磷酸緩沖液。

1.2.3.4 測(cè)定方法

提取酶液：稱取苜蓿幼苗葉片0.25 g，于預(yù)冷的研缽中，并加入預(yù)冷3 mL的50 mmol/L pH7.8的磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英沙研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2 mL上述磷酸緩沖液沖洗研缽轉(zhuǎn)入離心管于4℃下10 000 r/min離心15 min，離心所得上清液即為POD粗提液。

配制反應(yīng)液：取100 mL pH6.0的磷酸緩沖液，加入56 μL愈創(chuàng)木酚，加熱溶解后冷卻，再加入38 μL 30%H2O2，混合均勻保存于冰箱中備用。

POD測(cè)定：取光程為1 cm的玻璃比色杯2只，一只加入反應(yīng)液3 mL，50 mmol/L磷酸緩沖液1 mL作為調(diào)零管。另一只加入反應(yīng)液3 mL，提取的粗酶液1 mL，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，在470 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，開(kāi)始記錄數(shù)據(jù)，然后每隔半分鐘記錄一次吸光度值，共測(cè)2 min。測(cè)定結(jié)果按以下公式計(jì)算POD活性。

過(guò)氧化物酶活性=（△A470*VT）*（0.01FW*Vs*t）-1，其中：

A470——反應(yīng)時(shí)段內(nèi)吸光值的變化；FW——樣品鮮重（g）；VT——提取酶液總體積（mL）；Vs——測(cè)定時(shí)取用酶液體積（mL）；每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫前SNP對(duì)POD活性的影響

圖1 NaCi處理前SNP對(duì)苜蓿幼葉片POD活性的影響

由圖1可以看出，對(duì)照CK為僅用蒸餾水處理的植株，其表現(xiàn)正常生長(zhǎng)下苜蓿葉片的POD活性，它顯著低于4種SNP處理（P＜0.01），所有SNP處理中0.1 s處理的POD活性顯著高于其他SNP處理（P＜0.01），0.2 s、0.5 s、1.0 s處理依次降低。說(shuō)明與對(duì)照相比，在正常生長(zhǎng)條件下，4種濃度的SNP單獨(dú)處理可以顯著提高苜蓿POD活性（P＜0.01），其中以0.1 mmol/L SNP對(duì)酶活性的提高效果最好，0.2 mmol/L，0.5 mmol/L，1.0 mmol/LSNP對(duì)POD活性的影響都顯著低于0.1 mmol/LSNP（P＜0.01）。

圖2 鹽脅迫對(duì)苜蓿幼苗葉片POD活性的影響

2.2 鹽脅迫對(duì)POD酶活性的影響

由圖2可以看出，在進(jìn)行NaCl脅迫初期（0～24 h）POD活性顯著升高，隨著脅迫的持續(xù)，脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)，48 h后POD活性下降極顯著（P＜0.01），較24 h測(cè)定時(shí)下降92.4%，72 h后測(cè)定酶活性較48 h升高3倍多（336.6%），但仍顯著低于24 h測(cè)定值（P＜0.01）。與CK相比，N處理的POD活性始終顯著高于同時(shí)段的CK（P＜0.01）。由此可知，POD活性在脅迫初升高是因?yàn)橹参镒陨淼谋Ｗo(hù)系統(tǒng)通過(guò)提高內(nèi)源保護(hù)酶活性來(lái)抵抗外界環(huán)境脅迫，而長(zhǎng)時(shí)間的鹽脅迫使植物細(xì)胞過(guò)度損傷，膜系統(tǒng)無(wú)法繼續(xù)維持其穩(wěn)定性，但可能由于苜蓿本身具有耐鹽特性，加之幼苗期植株生長(zhǎng)較快，能夠緩解100 mmol/L NaCl脅迫，在脅迫72 h時(shí)體現(xiàn)出POD活性的上升。

2.3 SNP對(duì)苜蓿幼苗鹽脅迫下POD活性的影響

圖3是6種試驗(yàn)處理的苜蓿幼苗葉片的POD活性測(cè)定值圖示，其中圖3-A示不同濃度SNP+100 mmol/LNaCl處理苜蓿24 h時(shí)的測(cè)定值，從圖中可知，N處理顯著高于CK和4種SNP處理（P＜0.01），SNP處理中0.2 s顯著高于0.1 s、0.5 s、1.0 s處理，但都顯著低于CK（P＜0.01），說(shuō)明苜蓿具有的自身抗鹽性使其在100 mmol/L NaCl脅迫下能通過(guò)提高內(nèi)源保護(hù)酶POD活性增強(qiáng)抗氧化能力，緩解脅迫傷害。4種濃度的SNP處理其POD活性低于單獨(dú)鹽脅迫處理可能是因?yàn)椋很俎Ｈ~片在濃度為100 mmol/L鹽脅迫下，POD不是SNP緩解脅迫的主要作用目標(biāo)，所以SNP對(duì)POD活性影響不太明顯，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他保護(hù)酶的活性抵抗此濃度的鹽脅迫，本試驗(yàn)室也證實(shí)，SNP可提高100 mmol/LNaCl脅迫下的苜蓿葉片CAT活性，而對(duì)SOD活性影響不明顯。

圖3-B示不同濃度SNP+100mmol/L NaCl處理苜蓿48h時(shí)的POD測(cè)定值，可以看出，N處理和SNP處理顯著高于CK（P＜0.01），SNP處理中0.5s顯著高于其他，1.0s次之，二者都顯著高于0.1s和0.2s（P＜0.01），但所有處理整體低于24h時(shí)測(cè)定值，說(shuō)明SNP+NaCl處理48h時(shí)與對(duì)照相比，POD活性有所提高，SNP已經(jīng)對(duì)鹽脅迫下的苜蓿產(chǎn)生了一定保護(hù)作用，以0.5 mmol/L效果最好，1.0mmol/L次之。但因?yàn)辂}脅迫時(shí)間較長(zhǎng)，植物內(nèi)源保護(hù)酶POD的抗氧化能力不再增強(qiáng)，不能繼續(xù)維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，細(xì)胞損傷較重。

圖3 NaCl+SNP分別處理24 h、48 h、72 h時(shí)與CK和N處理間苜蓿幼苗葉片POD活性的比較

圖3-C示不同濃度SNP+100 mmol/LNaCl處理苜蓿72h時(shí)的POD測(cè)定值，其中N處理POD活性顯著高于CK（P＜0.01）和4種SNP處理（P＜0.01），0.5 s、1.0 s仍處于SNP處理中的最高水平，顯著高于0.1s和0.2s。由N處理可知苜蓿自身的抗鹽性使脅迫處理后期POD活性仍能保持在高于CK的水平。同時(shí)，0.5mmol/L和1.0 mmol/L SNP對(duì)長(zhǎng)時(shí)間100 mmol/L鹽脅迫下的苜蓿POD活性提高較0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的低濃度SNP效果好，說(shuō)明0.5 mmol/L和1.0 mmol/L SNP能夠較好緩解長(zhǎng)時(shí)間100 mmol/L NaCl對(duì)苜蓿幼苗葉片的膜損傷。

2.4 恢復(fù)生長(zhǎng)后POD的活性變化

由圖4可以看出，4種SNP處理顯著高于CK，0.5 s、1.0 s和N處理無(wú)極顯著差異（P＜0.01），均高于0.1 s和0.2 s處理（P＜0.01），可知在恢復(fù)生長(zhǎng)3 d后，單獨(dú)鹽脅迫處理的苜蓿因?yàn)樽陨磔^強(qiáng)的抗鹽性POD仍能保持較高活性，恢復(fù)較好。0.5 mmol/L和1.0 mmol/L SNP由于具有緩解100 mmol/L NaCl脅迫的作用，所以在恢復(fù)生長(zhǎng)后仍能使POD活性保持在較高水平，這也是SNP對(duì)植物細(xì)胞起保護(hù)作用的主要原因之一。

圖4 恢復(fù)生長(zhǎng)后POD活性

3 討論

植物鹽脅迫損傷是植物遭受逆境脅迫傷害中較常見(jiàn)的一種。鹽脅迫可導(dǎo)致植物自身活性氧代謝失調(diào)，最終使植物因細(xì)胞過(guò)渡損傷而死亡。但植物內(nèi)源保護(hù)系統(tǒng)可在一定程度上緩解鹽脅迫造成的傷害。在逆境脅迫下植物體可調(diào)動(dòng)保護(hù)系統(tǒng)中的酶類，如POD，用以抵御和消除活性氧，以維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。而NO作為一種活性氮，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境適應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，對(duì)植物也具有保護(hù)作用，但NO的保護(hù)作用與其有效生理濃度有關(guān)。

本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)不同濃度梯度的SNP對(duì)鹽脅迫下的苜蓿幼苗葉片的處理，探討NO對(duì)葉片POD酶活性的影響。試驗(yàn)中隨著脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)，SNP逐漸體現(xiàn)出對(duì)POD活性的調(diào)節(jié)作用，試驗(yàn)證實(shí)0.5 mmol/L和1.0 mmol/L SNP對(duì)苜蓿幼苗葉片在長(zhǎng)時(shí)間100 mmol/L NaCl脅迫下產(chǎn)生的損傷具有較好的緩解作用，能提高POD活性，減輕細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，從而減小損傷程度，對(duì)苜蓿抗鹽脅迫能力具有輔助作用。由試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果可以得出以下結(jié)論：苜蓿生長(zhǎng)在具高鹽堿土質(zhì)的區(qū)域，長(zhǎng)期的逆境脅迫，加之自然選擇的作用使苜蓿具有較強(qiáng)的耐鹽性，能通過(guò)提高內(nèi)源保護(hù)系統(tǒng)中的保護(hù)酶活性維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，抵抗外界環(huán)境的傷害。

從目前的研究來(lái)看，有關(guān)植物NO的研究大部分均試圖探討植物是否具有與動(dòng)物類似的機(jī)制，尤其是在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗逆以及信號(hào)轉(zhuǎn)達(dá)等方面。這種類比研究的方法為揭示植物NO的功能和作用機(jī)理提供了簡(jiǎn)便的途徑，也是未來(lái)植物NO研究所采用的主要方法和思路之一。

[1]王學(xué)征,韓文灝,于廣建.鹽分脅迫對(duì)番茄幼苗生理生化指標(biāo)影響的研究[J].北方園藝,2004,（3）：48-49．

[2]梁艷榮,胡曉紅,張穎力,等.植物過(guò)氧化物酶生理功能研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2003,2（26）：124-132．

[3]牟冬生.一氧化氮的研究進(jìn)展[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2001,18（1）：40-43．

（編輯：高真貞）

S551+.7

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1006-799X(2016)21-0100-03

李易興（1984-），女，甘肅蘭州人，助理工程師，主要從事漁業(yè)技術(shù)推廣工作。