細胞器損傷在急性胰腺炎腺泡細胞自噬中的研究進展

于曉政 劉瑞霞 陰赪宏

·綜述與講座·

細胞器損傷在急性胰腺炎腺泡細胞自噬中的研究進展

于曉政 劉瑞霞 陰赪宏

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是多種病因?qū)е乱认賰?nèi)胰酶異常激活，繼而引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的胰腺外分泌紊亂的炎癥性疾病，臨床以急性上腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱和血胰酶增高等為特征，是一種常見的急腹癥。為有效預(yù)防和治療AP，人們已將視角深入到研究調(diào)控胰腺炎炎癥反應(yīng)和腺泡細胞死亡的信號通路和分子機制上，然而對胰腺腺泡細胞的細胞器損傷所參與的異常自噬卻了解甚少。近年來，通過對體內(nèi)外AP模型的研究，人們發(fā)現(xiàn)AP中腺泡細胞內(nèi)幾個關(guān)鍵細胞器即自噬體、溶酶體、線粒體功能障礙在其發(fā)病機制中具有重要作用。本文就自噬、溶酶體、線粒體功能受損在AP發(fā)生和發(fā)展中的作用及相互影響作一綜述。

一、自噬與AP

1．自噬：過去認為自噬是細胞凋亡之外的第二種程序性細胞死亡方式，現(xiàn)普遍認為是一種防御與應(yīng)激的調(diào)控機制。自噬的進程包括4個方面。(1)自噬誘導(dǎo)：細胞在接受自噬信號刺激后，在胞質(zhì)內(nèi)形成特殊的圓形雙層膜結(jié)構(gòu)，形成自噬前體，是自噬形成的標(biāo)志之一[1]。(2)自噬體的形成：自噬前體不斷延伸，將受損、變性和失去功能的細胞、細胞器和變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子融合形成密閉球形結(jié)構(gòu)。(3)自噬溶酶體的形成：自噬體外層膜與溶酶體膜融合，內(nèi)層膜斷裂，將包裹物釋放，多個自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體。(4)自噬體內(nèi)容物的降解：自噬體內(nèi)的內(nèi)容物被釋放，在溶酶體酸性水解酶的作用下被降解。降解產(chǎn)物如氨基酸、脂肪酸、單糖等被送到胞質(zhì)，供細胞重新利用，殘渣則被排出細胞或滯留在胞質(zhì)中。細胞通過自噬途徑，在溶酶體、線粒體的參與下消除、降解和消化受損、變性和失去功能的細胞器和變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子，為細胞的重建、再生和修復(fù)提供原料，實現(xiàn)物質(zhì)的再循環(huán)和再利用；同時它還可以抵御病原體的入侵，保護細胞免受侵害，因此自噬既是細胞的“垃圾處理廠和廢物回收站”又是細胞的“防衛(wèi)者”。

2．自噬理論在AP中的發(fā)展史：1980年Helin等[2]在電鏡下觀察6例急性壞死性胰腺炎患者腺泡的超微結(jié)構(gòu)，除觀察到細胞器和酶原顆粒大小和數(shù)量的變化外，還發(fā)現(xiàn)可以從幾種吞噬泡數(shù)量的堆積和體積的改變推測吞噬活動的增強，這一發(fā)現(xiàn)成為自噬理論形成的雛形。2008年Ohmuraya和Yamamura[3]提出一個新型的理論，即AP中，自噬與胰蛋白酶原的激活有關(guān)。這一理論開啟了對自噬與AP關(guān)系的研究。隨后人們通過體內(nèi)外胰腺炎模型研究發(fā)現(xiàn)，自噬在AP的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。Gukovsky和Gukovskaya[4]提出AP的特征性反應(yīng)是未成熟的腺泡細胞酶原的激活、空泡的聚集、炎癥反應(yīng)、腺泡細胞的凋亡和壞死，而自噬受損是AP的關(guān)鍵病理反應(yīng)。Gukovsky和Pandol[5]提出在AP中自噬受損與幾種重要細胞器功能異常有很大關(guān)聯(lián)，即胰腺炎腺泡細胞中幾個關(guān)鍵細胞器自噬體、溶酶體、線粒體的功能損傷對AP的發(fā)生和發(fā)展具有促進作用，這個發(fā)現(xiàn)為研究者進一步探索AP中自噬與細胞器之間的關(guān)系提供了理論依據(jù)。

3．自噬受損與AP發(fā)病機制的關(guān)系：大量研究探討了健康和患病過程中自噬的不同角色，證實自噬與多種疾病的病理進程密切相關(guān)。AP的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬體缺乏、自噬體與溶酶體融合障礙，溶酶體降解功能異常等因素均能導(dǎo)致自噬受損。自噬受損導(dǎo)致大量空泡聚集[6]，空泡的積累和胰酶的活化是AP特征性的病理反應(yīng)。

二、AP中的溶酶體與自噬

1．溶酶體及其相關(guān)蛋白：溶酶體是真核生物細胞中主要起降解作用的細胞器，含有多種消化酶如蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、糖苷酶、脂肪酶、磷酸酯酶及硫酸脂酶等，是細胞內(nèi)的消化器官。溶酶體內(nèi)主要的消化酶類型是組織蛋白酶[7-8]，它們開始合成不具有活性的前體物質(zhì)，后經(jīng)過溶酶體路徑加工處理后被激活。被激活的組織蛋白酶通常在低pH(一般最適pH為5)下生物活性最大，其酸性環(huán)境靠空泡的ATP酶維持，將質(zhì)子從胞質(zhì)泵入溶酶體腔中[7]。Bakoyiannis等[9]發(fā)現(xiàn)溶酶體內(nèi)組織蛋白酶CatL和 CatB的成熟和激活與AP的發(fā)病機制有很大相關(guān)性， CatL具有降解胰蛋白酶原和胰蛋白酶的功能，CatB具有使胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶的功能，它們之間的穩(wěn)態(tài)在 AP中被打破，與其發(fā)病機制具有密切聯(lián)系。Ohmuraya等[3]也提出溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane proteins，LAMPs)與AP的關(guān)系。LAMPs是完整的膜蛋白，占溶酶體膜蛋白含量的一半以上。LAMPs被高度糖基化并被修飾后形成溶酶體內(nèi)膜表面上的一層保護衣，防止溶酶體膜被溶酶體水解酶水解，從而保持溶酶體結(jié)構(gòu)的完整性和功能的正常性；LAMPs還具有調(diào)節(jié)溶酶體與其他細胞器融合的功能，其中LAMP-2是自噬小體與溶酶體融合所必需的一種蛋白。Fortunato等[10]通過觀察酒精和內(nèi)毒素共同誘導(dǎo)的胰腺炎腺泡細胞，提出腺泡細胞中空泡的積累是由于LAMP-2的缺失引起，LAMP-2的缺失導(dǎo)致自噬溶酶體形成減少進而導(dǎo)致細胞內(nèi)自噬小體堆積。

2．AP中溶酶體受損與自噬受損：溶酶體不僅通過消化酶將內(nèi)吞的外源性物質(zhì)消化降解掉，而且還參與自噬清除細胞內(nèi)衰老的物質(zhì)[7]，是自噬進程中重要的參與者，通過降解細胞內(nèi)受損的細胞器和長壽蛋白，保證細胞生命的有序進行[11-13]。自噬的進程依靠自噬體與溶酶體的融合，產(chǎn)生自噬小體，融合后自噬小體的膜被降解掉。同時自噬正常的進程和終止依賴于溶酶體的正常功能，如溶酶體與自噬體的正常融合、溶酶體融合蛋白的水解活性保持高效性。AP中，自噬被異常激活，自噬的清除效率顯著下降，導(dǎo)致自噬進程的阻斷，自噬受損[1,4,14]。自噬受損最常見原因是溶酶體功能受損，自噬體與溶酶體無法融合，自噬體數(shù)量增加，同時由于溶酶體酶功能異常，空泡膜無法被降解清除掉，加重空泡量的積累。

3．AP中溶酶體受損的兩種機制：一種機制表現(xiàn)在溶酶體降解效率下降。通常情況下，人們將溶酶體降解長壽蛋白作為評價自噬效率的一個尺度，研究發(fā)現(xiàn)其效率在胰腺炎中被顯著抑制[3]，而且發(fā)現(xiàn)CatL和CatB在腺泡細胞中存在不平衡[9]，不具活性的溶酶體蛋白CatL和CatB單鏈形式被提前激活，而具有正?；钚缘碾p鏈形式量卻減少[5]，這種異常的激活不僅使腺泡細胞中胰酶量產(chǎn)生積累，而且使溶酶體的功能受到損傷，溶酶體降解效率下降產(chǎn)生自噬通路的延擱，形成異常自噬。因此，溶酶體降解功能的受損可能是胰腺腺泡細胞內(nèi)胰酶增加的主要機制。溶酶體功能受損的另一個機制是LAMP-1和LAMP-2量的減少[15]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)AP中LAMPs的降解發(fā)生在酸性區(qū)域并受組織蛋白酶調(diào)控?？梢酝茰y，胰腺炎中由于溶酶體功能受損，組織蛋白酶的異常激活和堆積，使它們在溶酶體中相互作用，定位被改變，LAMPs被組織蛋白酶水解掉，使溶酶體失去保護膜，更加劇了其自身的損傷，使自身降解異物的效率降低，產(chǎn)生惡性循環(huán)，加重胰腺炎的發(fā)展進程。

三、AP中的線粒體與自噬

1．線粒體及其相關(guān)蛋白：線粒體是存在于真核生物中具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，產(chǎn)生能量并以ATP的形式供細胞使用。作為一個能量制造者，線粒體在胰腺的外分泌生理和病理過程中都具有根本性的作用[16]。線粒體具有內(nèi)外雙層膜系統(tǒng)，外層膜系統(tǒng)主要功能是參與細胞質(zhì)間的信息交流；內(nèi)膜系統(tǒng)具有離子通道、蛋白運輸、產(chǎn)生能量等功能[7]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)是嵌在雙層膜上的蛋白復(fù)合體，起著連接線粒體內(nèi)外膜的作用。

2．AP中線粒體受損與自噬受損：線粒體在細胞處于饑餓環(huán)境、結(jié)構(gòu)調(diào)整或功能損傷的狀態(tài)下易形成自體吞噬并成為被降解的目標(biāo)。有學(xué)者用電鏡觀察雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺炎腺泡細胞的超微結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，自噬體中含有的細胞器包括線粒體[17]。自噬的正常進程不僅需要溶酶體降解細胞內(nèi)受損的細胞器和長壽蛋白[11-12]，還需要線粒體提供足夠的能量。因此可以推測，在AP中線粒體功能發(fā)生異常參與自噬受損的進程，細胞中受損細胞器增多，增加了溶酶體的使用率，使細胞對其清除效率要求增加，進一步加重溶酶體的負擔(dān)，同時線粒體的減少，使細胞內(nèi)能量供應(yīng)不足，加重AP的發(fā)展進程。

3．AP中線粒體受損的機制：MPTP介導(dǎo)的透化作用使線粒體功能受損。Lerch等[18]提出通過保護MPTP來預(yù)防胰腺炎的假說。MPTP介導(dǎo)的線粒體去極化是線粒體透化作用的重要媒介。在線粒體的內(nèi)外膜上，MPTP是一個高電導(dǎo)轉(zhuǎn)換孔， 親環(huán)蛋白D(cyclophilin, CypD)是其多孔蛋白中的一個關(guān)鍵蛋白。MPTP開放與否主要是由CypD對Ca2+的敏感性決定，其他因素如吡啶核苷酸、線粒體膜的脂質(zhì)成分等也可以對其產(chǎn)生影響。MPTP開放機制主要由Ca2+超載引起，MPTP開放，水滲透入裂隙，導(dǎo)致線粒體腫脹，外膜破裂[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在雨蛙素、脂多糖或者?；悄懰徕c注射、乙硫胺基絡(luò)酸(CDE)喂食的胰腺炎模型中，線粒體通過MPTP介導(dǎo)去極化，而CypD缺失的胰腺炎模型線粒體去極化則被很大程度抑制，因此可以推測，MPTP介導(dǎo)的線粒體去極化在AP中作為一個關(guān)鍵的早期病理事件出現(xiàn)。這種由于Ca2+介導(dǎo)PTP開放進而影響線粒體內(nèi)膜的去極化導(dǎo)致能量供應(yīng)的缺失是胰腺腺泡細胞能量代謝損傷一個重要病理過程[19]。這種去極化也是線粒體透化作用的一種表現(xiàn)。

4．線粒體透化作用與AP的嚴(yán)重性：有研究顯示，線粒體的透化作用在AP中決定著細胞的凋亡與壞死的平衡并與細胞內(nèi)的自噬有很大相關(guān)性，然而調(diào)控線粒體透化作用的分子機制還未明確。線粒體透化作用引發(fā)細胞凋亡跟壞死的一種表現(xiàn)是線粒體內(nèi)的細胞色素C蛋白(凋亡誘發(fā)因子)釋放入胞質(zhì)。細胞色素C一旦進入胞質(zhì)， 就刺激特殊的半胱氨酸蛋白酶活化，半胱氨酸蛋白酶可以調(diào)控降低凋亡的發(fā)生。另一種表現(xiàn)是線粒體膜蛋白缺失，最終導(dǎo)致ATP損耗和細胞壞死[5]。Maléth等[20]通過體內(nèi)外實驗證實，常見的胰腺炎誘導(dǎo)因子如膽汁酸、酒精和氧化應(yīng)激產(chǎn)物能使胰腺腺泡細胞和導(dǎo)管細胞內(nèi)的 ATP減少，預(yù)防線粒體損傷或者維持細胞內(nèi)ATP的水平對胰腺炎的病情進展具有減緩作用。因此可以推測，線粒體透化作用導(dǎo)致的線粒體損傷和ATP的缺失在細胞凋亡跟壞死的轉(zhuǎn)換中起到核心作用，即與胰腺炎的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。

綜上所述，AP中自噬被異常激活，溶酶體功能受損使其降解異物效率下降，進而導(dǎo)致自噬效率的降低；溶酶體CatL、CatB激活不平衡和LAMPs缺失導(dǎo)致自噬進程無法正常進行，使自噬受損；線粒體因為透化作用，使細胞器腫脹受損，合成ATP的功能下降，導(dǎo)致細胞能量匱乏；線粒體細胞色素C蛋白的釋放使caspases活化，降低了細胞凋亡，促進細胞向壞死方向轉(zhuǎn)化；線粒體膜蛋白的缺失，最終均會導(dǎo)致ATP損耗和細胞壞死。溶酶體、線粒體異常參與的自噬進程導(dǎo)致受損細胞器堆積，使自噬發(fā)生異常，更進一步加重了細胞清除異物的負擔(dān)促進了細胞壞死。而且線粒體去極化導(dǎo)致自身受損能顯著地激活自噬，尤其是線粒體自噬[21]。因此，溶酶體功能異常參與自噬進程，MPTP介導(dǎo)的線粒體去極化在AP早期起病程推動作用，受損細胞器的堆積增加了溶酶體參與自噬的清除負擔(dān)，線粒體ATP合成減少及其需求量的增加進一步加重了線粒體跟溶酶體的功能損害，起到了一個惡性“正反饋”作用，加重了AP的嚴(yán)重程度。這一損傷機制的明確為臨床上治療AP帶來了曙光，即尋找和探索某種藥物，能夠穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體內(nèi)水解酶的活性、減少線粒體去極化、保護線粒體的功能，維持細胞內(nèi)自噬的正常進行，從而維持細胞的穩(wěn)態(tài)。

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(本文編輯：冀凱宏)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.01.020

國家自然科學(xué)基金(81571933)

100050 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院感染內(nèi)科(于曉政、劉瑞霞)； 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)科(陰赪宏)

陰赪宏，Email: modscn@126.com

2015-12-07)