氨基酸及溶劑環(huán)境對(duì)牛骨膠原熱穩(wěn)定性的影響

劉麗莉，尹光俊，康懷彬，李　丹，王　煥

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

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氨基酸及溶劑環(huán)境對(duì)牛骨膠原熱穩(wěn)定性的影響

劉麗莉，尹光俊，康懷彬，李丹，王煥

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

摘要：以牛骨為原料提取酸溶膠原蛋白(acid soluble collagen，ASC)和酶溶膠原蛋白(pepsin soluble collagen，PSC)，分別測(cè)定其熱變性溫度并分析其氨基酸組成與分布。再以牛骨PSC為對(duì)象，研究了膠原所處溶劑環(huán)境(含水量、離子強(qiáng)度和pH值)對(duì)膠原熱穩(wěn)定性的影響。研究結(jié)果表明：牛骨ASC和PSC的熱變性溫度分別為70.30 ℃和69.93 ℃，均接近標(biāo)準(zhǔn)品，且在氨基酸組成與分布上相似。膠原蛋白中的亞氨酸和堿性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，膠原的熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。在一定范圍內(nèi)，隨著膠原含水量的增加，其熱穩(wěn)定性降低。在離子強(qiáng)度較低的體系范圍內(nèi)，膠原的熱變性溫度隨著離子強(qiáng)度的增加而降低。當(dāng)溶劑體系pH值為6.0時(shí)，膠原熱穩(wěn)定性最強(qiáng)。隨著pH值繼續(xù)升高或降低，熱穩(wěn)定性均降低。當(dāng)pH值過高或過低時(shí)，熱變性峰呈變小甚至消失趨勢(shì)，膠原發(fā)生變性。

關(guān)鍵詞：氨基酸；膠原蛋白；熱穩(wěn)定性；離子強(qiáng)度

0引言

膠原蛋白是以三股螺旋結(jié)構(gòu)聚合而成的纖維蛋白質(zhì)，主要存在于魚類及畜禽的皮、骨等副產(chǎn)物中。根據(jù)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)差異，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等多種類型，其中，以Ⅰ型為主要存在形式[1-2]。因其具有良好的生物相容性，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域中[3]。膠原受熱后不穩(wěn)定，三螺旋結(jié)構(gòu)解體，形成特殊的伸展結(jié)構(gòu)，即膠原的熱變性過程[4-5]。膠原熱變性后，所具備的部分功能特性也隨之降低或消失，因此，探究膠原的熱穩(wěn)定性及其影響因素具有重要意義。

牛骨中的Ⅰ型骨膠原，不但含量豐富且所含氨基酸(amino acid,AA)種類齊全，是一種營(yíng)養(yǎng)全面的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[6]，因此，對(duì)牛骨膠原的提取及深加工已成為近幾年的研究熱點(diǎn)。文獻(xiàn)[7]采用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解牛骨，研究了復(fù)合酶分步酶解提取牛骨膠原的最佳工藝。文獻(xiàn)[8]利用蛋白酶酶解法提取了牛骨膠原多肽，再對(duì)酶解后的骨渣進(jìn)行酸處理提取可溶性骨鈣，并與膠原多肽螯合，成功制得了牛骨膠原多肽螯合鈣。同時(shí)，針對(duì)膠原的熱穩(wěn)定性研究也日益增多。文獻(xiàn)[9]研究發(fā)現(xiàn)不同來源的Ⅰ型膠原在熱穩(wěn)定性能上存在差異，說明除分子構(gòu)象外，膠原化學(xué)組成亦是影響其熱穩(wěn)定性的重要因素。文獻(xiàn)[10]以兩種淡水魚皮為原料酶解提取膠原蛋白，并進(jìn)行膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性的分析，發(fā)現(xiàn)不同提取來源的膠原蛋白具有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但在氨基酸組成及熱穩(wěn)定性上均存在顯著差異。但目前針對(duì)熱穩(wěn)定性研究的膠原都提取自雞骨、豬皮和魚皮等，針對(duì)牛骨膠原熱穩(wěn)定性的研究還較少。因此，本文以牛骨為對(duì)象，研究了氨基酸及溶劑環(huán)境對(duì)牛骨膠原熱穩(wěn)定性的影響，為牛骨膠原的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

將新鮮牛骨充分洗滌并凍藏備用；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)，上?？颠_(dá)氨基酸廠生產(chǎn)；胃蛋白酶，豐達(dá)生物科技有限公司生產(chǎn)；氫氧化鈉，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；氯化鈉，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司生產(chǎn)；乙酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.99%)、鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%)、乙醚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.99%)和石油醚均由洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2儀器與設(shè)備

LGJ-10D型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；835-50型氨基酸分析儀，日本日立公司生產(chǎn)；DSC823e型差示掃描量熱儀，梅特勒-托利多公司生產(chǎn)；DYY-12型電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)。

1.3試驗(yàn)方法

膠原蛋白的所有提取和純化步驟均在溫度低于10 ℃的環(huán)境下完成。將修整洗凈的牛骨進(jìn)行超微粉碎，在V(無水乙醚)∶V(石油醚)=1∶1的溶液中浸泡24 h，脫脂后用去離子水反復(fù)洗滌、瀝干；隨后，用體積分?jǐn)?shù)為0.5%的鹽酸溶液浸泡48 h脫鈣，去離子水洗滌、瀝干后，用0.5 mol/L乙酸溶液搖浴24 h，離心分離上清液得到酸溶膠原蛋白(acid soluble collagen,ASC)粗提液。沉淀物繼續(xù)用含2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液搖浴24 h，分離上清液得到酶溶性膠原蛋白(pepsin soluble collagen,PSC)粗提液。

分別向ASC和PSC粗提液中添加氯化鈉至其濃度為0.9 mol/L，4 ℃鹽析24 h后過濾。所獲膠原蛋白沉淀用0.5 mol/L乙酸溶液復(fù)溶，離心(8 000 r/min，10 min)，上清液再次鹽析、乙酸復(fù)溶(重復(fù)3次)，最后得到的離心上清液依次經(jīng)0.1 mol/L的乙酸溶液及蒸餾水透析后，冷凍干燥得到純化的膠原蛋白樣品。參照文獻(xiàn)[11]的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)提取的產(chǎn)品進(jìn)行分析，得出提取物為保持完整三股螺旋結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原蛋白。

采用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)測(cè)定膠原樣品的熱變性溫度Td。稱取膠原樣品5 mg加入DSC鋁坩堝中并加蓋密封，測(cè)定前儀器用金屬銦進(jìn)行校正，用空鋁盒作對(duì)照。掃描溫度為20～100 ℃，升溫速率為5 ℃/min，樣品室氮?dú)饬魉贋?0 mL/min。

膠原蛋白樣品在密閉充氮條件下，用6 mol/L鹽酸于110 ℃水解24 h，隨后用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定蛋白質(zhì)氨基酸組成。

為了考察溶劑環(huán)境對(duì)膠原熱穩(wěn)定性能的影響，以牛骨PSC樣品為測(cè)試對(duì)象，采用DSC法(掃描溫度20～180 ℃，升溫速率5 ℃/min)測(cè)定膠原熱變性溫度，分別改變體系的含水量、pH值和離子強(qiáng)度等溶劑環(huán)境條件，研究膠原熱穩(wěn)定性能的改變。

(1)含水量的影響：稱取一定量膠原樣品添加去離子水溶脹，分別測(cè)定溶脹2 d、3 d、4 d、5 d和6 d后膠原的熱變性溫度。同時(shí)，以凍干牛骨PSC作為對(duì)照樣品，不加水溶脹直接測(cè)定。

(2)pH值的影響：以去離子水為溶脹劑，分別用0.5 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶脹劑體系pH值為7.0、6.0、5.0、4.0和3.0，在4 ℃條件下將膠原樣品溶脹3 d后測(cè)定熱變性溫度。

(3)離子強(qiáng)度的影響：以去離子水為溶脹劑(pH=7.0)，以氯化鈉作為離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)溶脹劑體系離子強(qiáng)度分別為20 mmol/L、50 mmol/L、200 mmol/L和300 mmol/L。同時(shí)以不添加氯化鈉的溶液作為對(duì)照組，在4 ℃條件下將膠原樣品溶脹3 d后，分別測(cè)定不同離子強(qiáng)度下的熱變性溫度。

2結(jié)果與分析

2.1牛骨膠原蛋白熱變性溫度圖譜分析

對(duì)牛骨中提取的ASC和PSC進(jìn)行差示掃描量熱分析，并與牛腱Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，結(jié)果如圖1和圖2所示。在天然狀態(tài)下，膠原是由三條肽鏈纏繞成的一個(gè)超螺旋結(jié)構(gòu)，加熱時(shí)其氫鍵斷裂，最終導(dǎo)致膠原蛋白三股螺旋鏈被破壞，由伸展的纖維狀態(tài)轉(zhuǎn)變成無規(guī)則卷曲狀態(tài)，并伴隨能量變化，因此，膠原蛋白的熱變性溫度是反映其天然螺旋結(jié)構(gòu)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，主要用于表達(dá)膠原蛋白的熱穩(wěn)定性[12]。由圖1和圖2可知：牛骨ASC和PSC分別在70.30 ℃和69.93 ℃出現(xiàn)了吸熱峰，此時(shí)膠原蛋白已經(jīng)完全變性。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)牛腱Ⅰ型膠原、PSC和ASC的DSC圖譜可以看出：三者的熱變性溫度基本接近，與已報(bào)道的魚類、牛皮和豬皮中所提取膠原蛋白的熱變性溫度相比明顯較高。經(jīng)圖譜分析表明：牛骨膠原蛋白樣品較好地保持了膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，且相對(duì)于牛骨PSC而言，牛骨ASC結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

圖1 牛骨酸溶膠原蛋白的差示掃描量熱分析圖2 牛骨酶溶膠原蛋白的差示掃描量熱分析

2.2氨基酸組成對(duì)膠原熱穩(wěn)定性的影響

一般蛋白質(zhì)含有20種氨基酸，膠原含有18種氨基酸，且有特別的組成。膠原的變性是指三螺旋結(jié)構(gòu)之間的氫鍵斷裂，螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則的線團(tuán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)生性質(zhì)的改變[13]。表1為牛骨膠原氨基酸組成，其中，所有膠原樣本的氨基酸組成均符合天然膠原的氨基酸組成特征，即除含有特征性氨基酸(羥脯氨酸)外，還富含甘氨酸、脯氨酸和谷氨酸，而甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總氨基酸的1/3以上。這也進(jìn)一步證明了提取的牛骨膠原蛋白為典型的具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原蛋白。由表1可知:牛骨膠原氨基酸組成中亞氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)豐富，且亞氨酸和堿性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在牛骨ASC中最高，牛骨PSC次之，標(biāo)準(zhǔn)品最低;而相應(yīng)的熱變性溫度也為牛骨ASC最高，標(biāo)準(zhǔn)品最低。說明牛骨膠原蛋白的熱變性溫度與亞氨酸和堿性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定相關(guān)性，這與文獻(xiàn)[14]關(guān)于脊椎動(dòng)物膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與亞氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)的研究結(jié)論相符。相比之下，水產(chǎn)膠原蛋白的亞氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)則偏低，其熱穩(wěn)定性也普遍較差，如草魚皮膠原的熱變性溫度僅為28.4 ℃。對(duì)于牛骨膠原蛋白，亞氨酸和堿性氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，其熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。

表1　膠原氨基酸(AA)組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

注：亞氨酸=脯氨酸+羥脯氨酸;堿性氨基酸=賴氨酸+精氨酸+組氨酸。

2.3溶劑環(huán)境對(duì)膠原熱穩(wěn)定性能的影響

膠原分子內(nèi)的少量水分子可在三條肽鏈之間起到氫鍵紐帶作用，從而穩(wěn)定膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)。文獻(xiàn)[15]研究了尿素和n-丙醇對(duì)鼠尾腱膠原蛋白黏度變化及變性溫度的影響，指出膠原的熱變性溫度取決于含水量、介質(zhì)pH值和膠原自身的交聯(lián)度。圖3是干燥牛骨PSC樣品的差示掃描量熱分析曲線，吸熱峰出現(xiàn)在140.30 ℃。圖4是牛骨PSC經(jīng)水溶脹的熱變性溫度變化曲線。由圖4可看出：溶脹后，膠原熱變性溫度降低。這是由于干燥樣品中不存在游離態(tài)水的介入，膠原分子間結(jié)合更為緊密，膠原三螺旋分子間的結(jié)構(gòu)也更穩(wěn)定。當(dāng)膠原經(jīng)水溶脹后，游離水分子進(jìn)入膠原樣品內(nèi)部，膠原分子間的結(jié)合結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致膠原三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，熱穩(wěn)定性下降。同時(shí)，隨著溶脹時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原的熱變性溫度也呈明顯下降趨勢(shì)。溶脹2 d時(shí)，膠原熱變性溫度測(cè)定值為73.30 ℃；溶脹5 d時(shí)，其熱變性溫度降低至69.40 ℃；繼續(xù)延長(zhǎng)溶脹時(shí)間，膠原熱變性溫度不再降低，趨于穩(wěn)定。

圖3 干燥牛骨PSC的差示掃描量熱分析圖4 水溶脹對(duì)牛骨PSC熱穩(wěn)定性的影響

膠原構(gòu)象的穩(wěn)定性有賴于分子間和分子內(nèi)的各種作用力的協(xié)同作用，酸、堿、熱和照射等均能不同程度地削弱各種作用力，從而破壞膠原構(gòu)象的穩(wěn)定性。膠原的變性是其構(gòu)象的改變，并不伴隨一級(jí)結(jié)構(gòu)中肽鍵的斷裂。利用差示掃描量熱法測(cè)量蛋白變性過程時(shí)，只要條件一定，蛋白在 DSC 圖上就有固定的吸熱峰；如果蛋白在測(cè)定前已經(jīng)變性，則吸熱峰變小、位移或消失。圖5是牛骨PSC樣品在pH值分別為3.0～9.0的水溶液中溶脹后的熱變性溫度變化情況。由圖5可知：當(dāng)pH值為6.0時(shí)，熱變性溫度最高；而隨著pH值的繼續(xù)升高或降低，膠原的熱變性峰值均越來越小，熱穩(wěn)定性減弱，說明H+和OH-對(duì)膠原熱穩(wěn)定性能均有負(fù)面影響。H+和OH-分別通過與膠原肽鏈內(nèi)部的酸性氨基酸和堿性氨基酸競(jìng)爭(zhēng)來減弱膠原內(nèi)肽鏈間的電荷吸引作用，從而降低膠原熱穩(wěn)定性能；在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿情況下，熱變性峰值則呈消失趨勢(shì)，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境會(huì)造成鯨鯊魚皮膠原變性的研究一致?？赡苡捎谠跇O端pH值下，膠原分子間的交聯(lián)鍵被破壞，最終導(dǎo)致膠原蛋白發(fā)生變性。

不同的離子強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的電荷屏蔽效應(yīng)，從而影響膠原分子間的靜電作用。圖6是牛骨PSC在不同濃度的氯化鈉水溶液(離子強(qiáng)度0～300 mmol/L)中溶脹后DSC的測(cè)定結(jié)果。

圖5 溶脹體系pH值對(duì)膠原熱穩(wěn)定性的影響 圖6 溶脹體系離子強(qiáng)度對(duì)膠原熱穩(wěn)定性的影響

由圖6可知：在較低濃度的氯化鈉溶液中，膠原會(huì)發(fā)生輕微的膨脹；隨著體系中離子強(qiáng)度的增加，膠原熱穩(wěn)定性隨之降低，這可能是由于氯化鈉與膠原蛋白分子骨架及側(cè)鏈上的基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)水分子形成氫鍵，使得膠原蛋白的氫鍵易于被破壞；但隨著體系離子強(qiáng)度的繼續(xù)增加，膠原的熱變性溫度又迅速升高，這是由于膠原蛋白-鹽的分級(jí)和聚合現(xiàn)象造成的。

3結(jié)論

(1)牛骨ASC和PSC的熱變性溫度分別為70.30 ℃和69.93 ℃，均與標(biāo)準(zhǔn)品接近。且熱變性溫度較高的牛骨ASC的氨基酸組成中，亞氨酸和堿性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別達(dá)到24.76%和12.77%，因此，針對(duì)牛骨膠原蛋白，亞氨酸和堿性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，膠原熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。這說明氨基酸的組成及分布可能是影響膠原熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)因素，氨基酸組成及分布改變，影響膠原分子肽鍵間的氫鍵和電荷相互作用，從而影響膠原結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

(2)隨著膠原在水中溶脹時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原含水量增加，熱穩(wěn)定性呈減弱趨勢(shì)。當(dāng)溶劑體系pH值為6.0時(shí)，膠原熱穩(wěn)定性最強(qiáng)；隨著pH值繼續(xù)升高或降低，膠原的熱變性峰值均變小甚至消失。在離子強(qiáng)度較低的體系內(nèi)，膠原的熱穩(wěn)定性隨著離子強(qiáng)度的增加而降低；進(jìn)一步增加離子強(qiáng)度則可能會(huì)造成膠原的蛋白-鹽的分級(jí)與聚合現(xiàn)象。這說明含水量、體系pH值和體系離子強(qiáng)度是影響牛骨膠原熱穩(wěn)定性的外部環(huán)境因素。

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中圖分類號(hào)：TS251

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2015-10-22

作者簡(jiǎn)介：劉麗莉(1974-),女,河南商丘人,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事生物技術(shù)和動(dòng)物食品方面的研究.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401622)

文章編號(hào)：1672-6871(2016)03-0073-05

DOI:10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2016.03.016