飼料中添加N-氨甲酰谷氨酸對(duì)中間球海膽成膽生長(zhǎng)、性腺發(fā)育、消化酶活力和免疫性能的影響

■ 左然濤 李 敏 李 廣 吳反修 常亞青 范文濤

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；2.全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣站中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)，北京100122；3.亞太興牧科技有限公司，北京100193）

中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）原產(chǎn)于日本北海道和俄羅斯遠(yuǎn)東沿海，由于其性腺色澤好、味甜，在國(guó)際市場(chǎng)廣受歡迎。1989年，大連海洋大學(xué)將其引入中國(guó)，現(xiàn)已成為我國(guó)北方重要的海水養(yǎng)殖品種。海帶、裙帶菜、石莼是海膽?zhàn)B殖的主要餌料來(lái)源。但是，鮮活生物餌料供應(yīng)極不穩(wěn)定，尤其是每年夏季高溫季節(jié)，只能以干品替代，且高溫期極易腐爛變質(zhì)，這嚴(yán)重降低了海膽的成活率、攝食量和生長(zhǎng)速率。配合飼料因其原料來(lái)源廣泛、營(yíng)養(yǎng)搭配均衡、飼料利用率高成為海膽?zhàn)B殖產(chǎn)業(yè)獲得突破性發(fā)展的關(guān)鍵。目前，配合飼料在北方球海膽（S.droebachiensis）、加州紅海膽（S.franciscanus）、Evechinus chloroticus和中間球海膽（S.intermedius）親膽中已有報(bào)道，結(jié)果表明配合飼料在降低餌料系數(shù)，提高海膽性腺指數(shù)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面具有生物餌料無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。

精氨酸對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫促進(jìn)作用的研究已有較多報(bào)道，其中精氨酸代謝產(chǎn)生的一氧化氮（NO）被認(rèn)為在免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。此外，陸生動(dòng)物中的研究表明飼料中添加精氨酸能夠提高性腺發(fā)育和產(chǎn)仔數(shù)量。但是，目前精氨酸價(jià)格昂貴，不適合規(guī)?；暳仙a(chǎn)使用。N-氨甲酰谷氨酸（NCG）由于價(jià)格低廉且具有精氨酸相似的生理功效成為較為理想的精氨酸替代物。陸生動(dòng)物中的研究表明，NCG可有效激活氨甲酰磷酸合成酶，提高動(dòng)物體內(nèi)精氨酸的合成速率，從而提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)速率，改善母豬的繁殖性能以及公豬的精液質(zhì)量。但NCG對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生理影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以中間球海膽為研究對(duì)象，探討了飼料中添加NCG對(duì)海膽生長(zhǎng)、性腺發(fā)育、消化酶活力和免疫性能的影響，以期為海膽促熟期間配合飼料中NCG的添加提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料配制

以海藻粉和豆粕為主要蛋白源，魚(yú)油和豆油為主要脂肪源，通過(guò)梯度添加NCG配制6種等氮（粗蛋白，21%；粗脂肪，4%）的試驗(yàn)飼料，使飼料NCG水平依次為0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、1.00%（配方見(jiàn)表1）。所有粉狀原料粉碎后過(guò)100目篩，并按照配比將飼料干粉進(jìn)行充分混合，然后將魚(yú)油、豆油和卵磷脂的混合物均勻添加至上述干粉飼料中。隨后，向加過(guò)油的原料中添加30%自來(lái)水并利用混勻機(jī)充分混合均勻。利用制粒機(jī)制粒（3 mm×3 mm）。制作好的飼料于40℃烘箱烘干，冷卻后用雙層塑料袋包裝，儲(chǔ)存于陰涼干燥處備用。

表1 飼料配方(%飼料干物質(zhì))

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所需的2齡中間球海膽購(gòu)自大連旅順龍王塘某養(yǎng)殖場(chǎng)，試驗(yàn)開(kāi)始前將其放置于1 000 L的水槽中進(jìn)行暫養(yǎng)，每天換水和投喂配合飼料1次（17∶00），換水比例為總體積的50%。經(jīng)過(guò)2周馴化，將大小均勻、健康無(wú)病的海膽[初始體重：(62.0±1.4)g]分養(yǎng)至21個(gè)網(wǎng)籠（直徑15 cm，高20 cm）中，試驗(yàn)網(wǎng)籠掛放在1 000 L藍(lán)色玻璃鋼水槽中，每個(gè)網(wǎng)籠投放20只海膽。每種飼料分別隨機(jī)投喂三個(gè)網(wǎng)籠的海膽，另有三個(gè)網(wǎng)籠投喂海帶作為對(duì)照。

ATLAS軟件的設(shè)計(jì)采用了先進(jìn)的面向?qū)ο蟮脑O(shè)計(jì)模式，使用多態(tài)、虛擬繼承與模板技術(shù)，在保證程序性能的前提下最大限度降低了程序模塊之間的耦合性，具有非常高的可擴(kuò)展性并且易維護(hù)。

1.3 養(yǎng)殖管理

Nfi和Nft——分別是攝食生長(zhǎng)試驗(yàn)初期和末期試驗(yàn)海膽的數(shù)目；

1.4 消化酶活力測(cè)定

支氣管熱成形術(shù)(bronchial thermoplasty, BT)通過(guò)射頻消融支氣管平滑肌(airway smooth muscle, ASM)用于支氣管哮喘的治療，但主要針對(duì)難治性支氣管哮喘，目前已在國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了一些試驗(yàn)研究，并取得了初步的臨床效果，現(xiàn)綜述如下。

1.5 免疫相關(guān)酶活力測(cè)定

海膽體腔液免疫相關(guān)酶活力采用南京建成試劑盒進(jìn)行測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）活力定義為每毫升體腔液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)多對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）；過(guò)氧化氫酶（CAT）活力定義為每毫升體腔液每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個(gè)活力單位；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）活力定義為每毫升體腔液在37℃反應(yīng)1 min，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/l為一個(gè)酶活力單位；堿性磷酸酶（AKP）的活力定義為每毫升體腔液在37℃條件下15 min產(chǎn)生1 mg酚為一個(gè)活力單位。

1.6 計(jì)算和統(tǒng)計(jì)方法

持續(xù)長(zhǎng)度是該模型的一個(gè)基本參數(shù).持續(xù)長(zhǎng)度與自由旋轉(zhuǎn)鏈的處理方法有異曲同工之妙,因?yàn)槎叨疾捎昧撕箧I依次在前一鍵上投影并依此前推至所需鍵的計(jì)算方法.自由旋轉(zhuǎn)鏈因?yàn)樾枰墟I之間進(jìn)行兩兩點(diǎn)乘,因此其平均范圍廣,需要大量樣本的統(tǒng)計(jì)平均方可采用投影法進(jìn)行平均處理.持續(xù)長(zhǎng)度涉及的是各個(gè)鍵在第一個(gè)鍵方向上投影,一旦鍵的方向與第一個(gè)鍵相反,它在z軸方向的投影就是負(fù)值.經(jīng)平均處理后,負(fù)值就不再出現(xiàn),代之以收斂于0的投影值.因此,持續(xù)長(zhǎng)度的計(jì)算同樣應(yīng)該是大量連接單元的統(tǒng)計(jì)平均值.

將-80℃保存的腸道在冰上解凍，按重量（g）∶體積（ml）=1∶9比例加入生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，冷凍離心（4 ℃，2 500 r/min）10 min后留取上清液。胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、總蛋白含量測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。利用Epoch酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）對(duì)顯色溶液吸光度進(jìn)行測(cè)定。其中，每毫克組織蛋白，37℃下，每分鐘分解蛋白生產(chǎn)1 μg氨基酸相當(dāng)于1個(gè)胃蛋白酶活力單位；每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位；在37℃條件下，每克組織蛋白與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個(gè)脂肪酶活力單位。

試驗(yàn)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)周期為56 d。試驗(yàn)期間，每天換水一次，換水比例為玻璃鋼水槽容積的50%。換水時(shí)吸底，以清除水槽底部的殘餌和糞便，每次換水后投喂配合飼料（17∶00）。試驗(yàn)期間，溶氧＞5 mg/l，水溫保持在（15±2）℃，鹽度為28～30。攝食生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)每個(gè)網(wǎng)籠中的海膽進(jìn)行計(jì)數(shù)并稱重，每個(gè)網(wǎng)籠取6只海膽，解剖并稱量性腺以計(jì)算性腺指數(shù)，分離消化道并收集于1.5 ml離心管中，用1 ml注射器吸取體腔液，離心5 min（4 ℃，3 000 r/min），將上清液移至新的1.5 ml離心管，消化道和體腔液上清液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

針對(duì)局部給藥方面，有臨床相關(guān)研究者提出[5] ，通過(guò)將不同劑量紫杉醇涂層支架，植入至豬心的冠脈左前降支部位，經(jīng)1個(gè)月后行冠狀動(dòng)脈造影，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同組的新生內(nèi)膜面積，會(huì)隨著紫杉醇劑量的不斷增加呈減少趨勢(shì)。針對(duì)全身給藥方面研究，有臨床研究學(xué)者提出，通過(guò)將不同劑量紫杉醇（微粒型），注入兔雙側(cè)骼動(dòng)脈的內(nèi)部剝落部位，劑量較高的一組相較劑量較低的一組，新生內(nèi)膜皮平均厚度明顯較低。

G——海膽性腺的重量(g)。

攝食配合飼料和海帶的海膽在蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶方面未見(jiàn)顯著性差異，說(shuō)明配合飼料可被海膽很好地接受并利用。NCG的添加并未顯著影響中間球海膽腸道消化酶活力（P＞0.05）。從生長(zhǎng)指標(biāo)來(lái)看，NCG的添加未對(duì)海膽生長(zhǎng)速率產(chǎn)生顯著影響，這也可能與NCG未改變海膽消化酶活力有關(guān)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 飼料中添加NCG對(duì)中間球海膽成活率、增重率和性腺發(fā)育速率的影響（見(jiàn)表2）

表2 飼料中添加NCG對(duì)海膽成膽生長(zhǎng)和性腺指數(shù)的影響

海帶處理組海膽體腔液SOD和CAT活力顯著高于未添加NCG飼料組，而添加NCG不同程度提高了海膽體腔液中SOD和CAT的活力。隨著飼料中NCG添加量的升高，海膽SOD和CAT活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)NCG添加量為0.12%和0.16%時(shí)，海膽分別具有最高SOD活力和最高CAT活力，顯著高于未添加NCG處理組（P＜0.05）。過(guò)量添加NCG（1%）有降低海膽SOD和CAT活力的趨勢(shì)（P＞0.05）。海膽體腔液中GST和AKP活力在各飼料組間差異不顯著（P＞0.05）。

式中：Wf和Wi——分別是海膽平均末重和平均初重(g)；

2.2 飼料中添加NCG對(duì)中間球海膽消化酶活力的影響（見(jiàn)表3）

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在單因素方差分析達(dá)到顯著水平時(shí)（P＜0.05），采用Turkey's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式。

2.3 飼料中添加NCG對(duì)中間球海膽免疫性能的影響（見(jiàn)表4）

表3 飼料中添加NCG對(duì)海膽成膽消化酶活力的影響(U/mg Pro)

表4 飼料中添加NCG對(duì)海膽成膽免疫性能的影響(U/ml)

中間球海膽的成活率均大于90%，且各處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。飼料中添加NCG對(duì)海膽的終末體重和增重率均未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。配合飼料組海膽性腺指數(shù)均高于海帶組，隨著飼料中NCG添加量的升高，海膽性腺指數(shù)顯著升高，并當(dāng)NCG添加量為0.12%時(shí)具有最大值（14.76%），與0.16%和1.0%NCG組差異不顯著，但顯著高于NCG未添加組和低添加量組（0.04%～0.08%）的性腺指數(shù)（P＜0.05）。

閥廳屋蓋上的單軌吊車及懸掛設(shè)備荷載如圖2所示。屋蓋上設(shè)置7座單軌吊車，計(jì)算時(shí)考慮2座吊車同時(shí)運(yùn)行。設(shè)備荷載按照集中荷載考慮，位置按實(shí)布置，每處吊點(diǎn)集中荷載標(biāo)準(zhǔn)值20 kN。

3 討論

3.1 飼料中添加NCG提高了海膽性腺指數(shù)

本研究中，飼料中添加0.12%的NCG能顯著提高海膽的性腺指數(shù)。這與陸生動(dòng)物中的研究結(jié)果相一致。飼料中添加0.1%的NCG顯著提高了母豬所產(chǎn)仔豬的數(shù)量和出生重量。這可能是由于NCG能夠促進(jìn)精氨酸的內(nèi)源性合成，從而間接增加日糧中精氨酸含量。已有研究證明飼料中添加1%的精氨酸能夠顯著提高母豬每窩活仔數(shù)和出生體重。此外，精氨酸在體內(nèi)分解代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多氨。多氨在DNA和蛋白質(zhì)合成中起調(diào)控作用，因此也調(diào)控著機(jī)體的細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)性腺組織的分化和增長(zhǎng)。

3.2 飼料中添加NCG促進(jìn)了海膽非特異性免疫力

本研究中，與不添加NCG飼料組相比，添加NCG顯著提高了海膽體腔液中SOD和CAT活力，且與海帶處理組具有相當(dāng)?shù)乃健钇降劝l(fā)現(xiàn)飼料中添加0.1%或1.0%NCG顯著提高了妊娠期母豬的免疫力。精氨酸已被證實(shí)在多種陸生動(dòng)物中發(fā)揮免疫促進(jìn)作用，尤其是當(dāng)動(dòng)物機(jī)體處于亞健康狀態(tài)時(shí)這種免疫促進(jìn)作用更為顯著。在水產(chǎn)動(dòng)物中研究相對(duì)較少，Buentello等研究發(fā)現(xiàn)2%～4%精氨酸能夠顯著提高斑點(diǎn)叉尾鮰的免疫力和抗病力。Cheng等發(fā)現(xiàn)精氨酸能夠提高美國(guó)紅魚(yú)和雜交條紋鱸的免疫力。有關(guān)精氨酸調(diào)控機(jī)體免疫性能機(jī)制的研究已有諸多報(bào)道，其中精氨酸體內(nèi)代謝產(chǎn)物NO被公認(rèn)為參與動(dòng)物免疫反應(yīng)。NO是動(dòng)物體以精氨酸為底物在NO合成酶的作用下合成的，F(xiàn)erid Murad因其發(fā)現(xiàn)NO作為信號(hào)分子具有松弛平滑肌細(xì)胞和擴(kuò)張血管的作用被授予諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。NCG是精氨酸內(nèi)源合成途徑中關(guān)鍵酶（CPS-1）的有效激活劑，能增加精氨酸的內(nèi)源合成，從而通過(guò)精氨酸間接發(fā)揮免疫調(diào)控作用。

4 結(jié)論

飼料中添加NCG并未改變中間球海膽生長(zhǎng)速率和消化酶活力，但卻顯著影響了其性腺發(fā)育速率和免疫性能。綜合性腺發(fā)育和免疫指標(biāo)，推薦中間球海膽成膽配合飼料中NCG的添加量為0.12%～0.16%飼料干物質(zhì)。

（參考文獻(xiàn)刊略，需者可函索rtzou@dlou.edu.cn）