黃曲霉毒素B1的高效去除技術與工程化研究進展

■謝 慧 李志敏 曹勝炎 王風芹 楊 森 張軍峰 宋安東*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點實驗室,河南鄭州450002；2.河南雙成生物科技有限公司，河南漯河463900）

20世紀60年代初，科學家從發(fā)霉的花生餅中分離出黃曲霉毒素，至此人們逐漸開始對黃曲霉毒素進行研究[1]。黃曲霉毒素是一類由黃曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，被WHO評為劇毒類物質(zhì)。其結構式中含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰酮，有研究表明雙呋喃環(huán)為基本毒性結構，而氧雜萘鄰酮則與致癌有關[2]。

黃曲霉毒素有二十幾種，常見的有黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2。其中黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最強，因此被用來作為黃曲霉毒素的評價指標。

1 國內(nèi)外AFB1的污染狀況

黃曲霉喜歡潮濕溫和的環(huán)境。夏季，常常發(fā)現(xiàn)飼料或農(nóng)作物發(fā)生霉變。將大米放置在20℃，濕度為70%的環(huán)境中儲存3個月后，檢測到霉變的大米中AFB1的含量高達5 μg/kg[3]。黃曲霉毒素污染問題已經(jīng)是一個全球性的問題，據(jù)2001年FAO評估全球有25%的農(nóng)作物被黃曲霉毒素污染。

在中國，最易受到黃曲霉毒素污染的食品有糧油、醬油、堅果、玉米等。孫秀蘭等[4]抽查了5個省份，203個醬油樣品，結果顯示AFB1的檢出率為100%，其中有的醬油樣品AFB1的污染量接近歐盟的限量標準。同時，食用油也是我國重點關注的對象，劉輝等[5]在2014年內(nèi)從各大地區(qū)抽取1 103份食用油樣品進行AFB1的污染調(diào)查，其中有24份樣品不合格，不合格樣品中主要是花生油，所有檢測出的不合格樣品中AFB1含量均大于10 μg/kg。除食品外，飼料也常常受到黃曲霉毒素的污染，劉鳳芝等[6]對10個省份的飼料進行抽樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)玉米副產(chǎn)物和蛋白飼料中AFB1污染嚴重，玉米中AFB1檢出率達95.12%，下面依次是粕類、配合飼料、玉米加工副產(chǎn)品物、發(fā)酵飼料、小麥及加工副產(chǎn)物等其他飼料。

國外，Rouhollah等[7]對伊朗2006-2008年的玉米污染AFB1情況進行調(diào)查，調(diào)查區(qū)域有西北、西南及南部冰島，結果顯示西北地區(qū)AFB1檢出率高于其他兩個區(qū)域，甚至在2008年，抽查樣本中100%感染了AFB1，而且 AFB1的污染量達 154.13 mg/kg。Ines Rodrigues[8]對北亞、東南亞、南亞、大洋洲和美洲5個區(qū)域1 086份樣品飼料進行檢測，發(fā)現(xiàn)有31%的樣品污染了黃曲霉毒素，其中南亞地區(qū)的AFB1的污染率高達71%。Kang’ethe EK1等[9]從肯尼亞抽取了830份動物飼料樣品，來自農(nóng)民的飼料樣品有86%污染AFB1，污染的樣品中67%超過FAO的限量標準；81%的飼料廠中飼料樣品被AFB1污染，污染的樣品有58%達到FAO規(guī)定的上限。

2 AFB1的危害

黃曲霉毒素B1毒性特別強，其毒性為氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，敵敵畏的100倍[10]，嚴重危害著人類和動物的健康。人類患癌癥的概率與當?shù)攸S曲霉污染量息息相關，有研究者從中國的淮安（食管癌高發(fā)區(qū)）、扶綏（肝癌高發(fā)區(qū)）、桓臺（食管癌和肝癌低發(fā)區(qū)）三個地方共抽取了209個食物樣品，淮安的AFB1污染量為13.5 μg/kg，扶綏的污染量為2.3 μg/kg，兩地均大于桓臺的AFB1的污染量1.3 μg/kg。由此可見，AFB1污染越嚴重，人類患癌癥的機率越大[11]。王瑞國等[12]用不同劑量的AFB1喂養(yǎng)雛鴨，發(fā)現(xiàn)隨著AFB1染毒劑量的增加，對雛鴨肝細胞DNA損傷越大。動物和人類體內(nèi)攝入AFB1后，AFB1被細胞色素-P450酶利用后代謝成活性中間體AFB1-8,9環(huán)氧化物，此中間產(chǎn)物會與肝細胞DNA結合，形成DNA加合物，DNA加合物與肝細胞DNA鳥嘌呤堿基相互作用后，會引起肝癌[13]。

3 AFB1的去除技術

目前，市場上存在的去除方法很多，主要有物理方法、化學方法、生物方法等。

3.1 物理法

物理法通過高溫加熱，紫外線照射使AFB1結構破壞或通過吸附劑將AFB1吸附從而達到去除AFB1的效果。Jongin Lee等[14]將大豆置于高壓鍋中滅菌，與不用高壓鍋滅菌處理比較，AFB1的含量大大減少。大豆分別于100℃和150℃中各加熱90 min，AFB1可減少41.9%和81.5%，隨著溫度的升高AFB1破壞的越厲害。王守經(jīng)等[15]研究了高能電子束和γ-射線對AFB1輻射降解效果，發(fā)現(xiàn)隨著輻射強度的增加，AFB1的降解率越高。Ksenija Markov等[16]的研究也證明了這一點，對47個天然污染的玉米樣品用5-kGyγ-射線輻射后，AFB1的去除率達69.8%，10-kGyγ-射線照射后，AFB1的降解率提高到94.5%。李娟娟等[17]通過體外試驗和動物飼養(yǎng)試驗，研究酵母培養(yǎng)物提取物、水合鋁硅酸鹽和兩者復合物這3種吸附劑對AFB1的吸附效果。研究表明，鋁硅酸鹽類吸附劑吸附效果最佳，在pH值8.0、10 min內(nèi)吸附率達97.69%，且60 min內(nèi)吸附率一直處在96.03%以上。

物理法去除黃曲霉毒素的方法操作簡單，容易得到大規(guī)模的推廣，且不需要耗費大量試劑、節(jié)約能源、成本低，但是也存在去除效率低、耗時等缺點。在用吸附劑吸附毒素時，吸附上的毒素會重新脫落下來而造成去除效率低和二次污染。

3.2 化學法

化學法去除AFB1的方法包括強氧化劑和堿處理，這兩種方法都是通過使AFB1的某些化學鍵打開而達到去除效果。臭氧是一種強氧化劑，將污染AFB1的花生放置到一個臭氧發(fā)生器中，通入濃度50 mg/l，流速為5 L/min臭氧，熏蒸60 h后，檢測到有89.4%的AFB1被降解[18]。除臭氧外，有人用10 g/L、料液比的5∶1（ml/g）二氧化氯溶液處理30 g(98.60 μg/kg）染有B族黃曲霉毒素的花生的霉變（浸泡30 min，處理后，黃曲霉毒素含量小于20 μg/kg，達到國標GB 2761—2005對花生中黃曲霉毒素含量的要求。隨著二氧化氯溶液濃度的提高，液料比的增加，作用時間的延長，花生中B族黃曲霉毒素的含量越低,脫毒效果越好[19]。

堿可以打開AFB1的內(nèi)脂環(huán)，生成無毒性或毒性較小的物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)弱堿高溫處理法對花生粕原料中的AFB1有較好的去除效果。花生粕在121℃，pH 10條件下處理60 min后，AFB1的破壞率高達84.50%[20]?；ㄉ驮?3.42%堿濃度下，AFB1的含量從34.78 μg/kg下降到0.37 μg/kg[21]。

化學法操作簡單，去除效果極佳，而且成本低?；瘜W法所用的試劑有強氧化性，比如臭氧，雖然能有效去除黃曲霉毒素，但是如果操作不當會對操作人員造成傷害，污染環(huán)境?；瘜W試劑會破壞飼料的營養(yǎng)物質(zhì)，同時所加入的試劑很難回收，對飼料造成二次污染等。

步驟3 為不失一般性，對定標信號進行每隔兩個抽取一個，共抽取2 000幀信號，利用式(3)和式(4)計算該2 000幀的幅度和相位誤差值，并計算幅度和相位誤差的平均值和

3.3 生物法

黃曲霉毒素的生物脫毒主要是通過微生物或其產(chǎn)生的酶制劑來進行脫毒，目前報道的生物脫毒的微生物有枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、酵母菌、黑曲霉等，酶制劑有錳過氧化物酶、葡糖糖氧化酶等。

Mohsen Farzaneh等[22]分離出了一株能夠降解的枯草芽孢桿菌菌株UTBSP1，該菌株可以降解肉湯培養(yǎng)基中AFB1，降解率為85.66%，降解開心果中95%的AFB1。Ali Topcu等[23]研究了屎腸桿菌降解AFB1的能力，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)48 h后，大約有40%的AFB1被降解。有研究分別采用高溫高壓法、添加1%乳酸菌和1%酵母菌這3種方法處理試樣，并測定其AFB1含量。結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫和高壓處理可破壞27.7%的AFB1；經(jīng)乳酸菌30℃厭氧培養(yǎng)72 h，可使99.4%的AFB1得到破壞；經(jīng)酵母菌30℃培養(yǎng)72 h可使83.4%的AFB1得到降解[24]，由此可見，生物法去除AFB1更加高效。

除此之外，酶制劑也被人廣泛研究，有研究發(fā)現(xiàn)白腐菌種中的錳過氧化物酶可去除86.0%的AFB1[25]；用5%的25 U/g葡萄糖氧化酶完全可以解除飼料中500 μg/kg濃度AFB1的毒性[26]。

生物降解法是目前最環(huán)保最高效的降解方法，不僅可以有效降解毒素，還能提高飼料或食品的營養(yǎng)價值，不會造成二次污染。生物法有其一定的場地局限性，有的需要無菌操作等，所以不利于大規(guī)模工程化使用。

4 黃曲霉毒素B1的去除機理

黃曲霉毒素的結構式中含有雙呋喃環(huán)和氧雜萘鄰酮，結構較為復雜，所以其降解途徑也較為復雜。目前，人們對AFB1的降解途徑研究甚少，而且不同的去除方法，對應不同的降解產(chǎn)物。有關物理和化學方法去除機理的報道很少，有些報道只是簡單地敘述了降解途徑，具體的鍵的斷裂與重組沒有過多涉及，甚至有研究對其降解途徑進行了猜想，但沒有完全證實。

目前，有關生物降解機理的報道較多，Wang J等[25]研究了白腐菌中錳過氧化物酶降解AFB1的途徑，AFB1被錳過氧化物第一次成了AFB1-8,9-氧化物，之后被水解成AFB1-8,9-二氫二醇，降解產(chǎn)物的毒性遠遠小于AFB1。Chen等[27]在通過嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞菌厭氧固態(tài)發(fā)酵生物轉化AFB1研究中，對降解機制進行了猜想，他們假定AFB1綁定在花生蛋白上，進過加熱處理后，AFB1從蛋白上脫落下來，小部分的AFB1轉換成毒性較弱的AFD1，大部分的AFB1進過厭氧固態(tài)發(fā)酵后，在用高效液相分析時，顯示AFB1被三氯醋酸衍生成無毒的AFB2a。

Melvin S Samuel等[28]通過惡臭假單胞桿菌對AFB1進行解毒，并且對其降解產(chǎn)物進行了分析，報道中顯示有三種降解產(chǎn)物，前兩種降解產(chǎn)物是AFB1的內(nèi)脂環(huán)打開導致脫碳作用形成的，第三種降解產(chǎn)物是苯酐，但是關于苯酐的形成機理尚不清楚。

Wajiha Iram等[29]對檸檬酸降解AFB1的降解機制進行了詳細敘述，AFB1有6種裂解途徑，形成8種降解產(chǎn)物。降解產(chǎn)物的形成主要是H、CO和CO2的缺失，或者和-OH的添加，或者碳的添加等。

5 黃曲霉毒素B1去除方法的工程化應用

5.1 物理挑選法

色選機是工廠中普遍采用的物理挑選法來去除黃曲霉毒素的設備，目前已經(jīng)投入生產(chǎn)，其工作原理是利用光學系統(tǒng)，根據(jù)正常糧食和霉變糧食的顏色不同，正常糧食按原路自由落體下去，霉變糧食被吹出，從而達到分離效果[30]。色選機設備如圖1所示[31]。

色選機在糧食生產(chǎn)中應用比較廣泛，據(jù)林茂先等[32]報道，6SXM-XXXXBW型小麥色選機每小時至少可以篩選4 t小麥，多者可達26 t，經(jīng)過色選后的小麥品質(zhì)發(fā)生了較大的變化，常規(guī)清理設備清除不掉的病斑、霉變的小麥顆粒及赤霉病等有害顆粒被色選機基本清除，清除率高達99.7%。由浙江齊鯉機械有限供公司生產(chǎn)的MSXG-120型大米色選機，采用雙向篩選室，并安裝了高敏度傳感器，使能更徹底地分離出微小色差的物體，其每小時可色選2～4 t的大米[33]。

圖1 色選機

除色選機外，市場上還存在一種大米刷糠機，其依據(jù)面粉廠的刷麩機改造而成，每小時可刷3.5 t以上的大米，從實驗結果可以看出，對于污染較輕的大米去毒效率可達100%，然而對于污染較嚴重的大米則去毒效率不高[34]。大米經(jīng)過刷糠機后，AFB1得到高效去除，同時大米的質(zhì)量也得到了有效改善。

5.2 紫外照射法

花生、大豆等作物在種植過程中，會受黃曲霉污染，經(jīng)壓榨成食用油后，毒素會隨之進入油中，食用油中黃曲霉毒素的去除常采用紫外線照射。壓榨花生油工藝的生產(chǎn)線是先將原料經(jīng)壓榨物理精選后，采用紫外瞬時輻照技術去除AFB1。壓榨好的花生油通過紫外照射裝置時，受到紫外線發(fā)生器產(chǎn)生的紫外線照射，使液體中的黃曲霉毒素分解，當多個照射裝置串聯(lián)后連續(xù)照射液體，含毒量大于50 μg/kg的花生油，處理后油中毒素可降至20 μg/kg以下。這一套裝置已經(jīng)成熟，從1982年至1985年試機中，累計處理含毒花生油690 t[35-37]。張小勇等[38]研制了一套采用UVA紫外燈輻照的方式連續(xù)降解食用植物油中AFB1的設備，該設備功率小，能耗少，且可實現(xiàn)在線清洗，保證了輻射解毒效果，在輻照反應15 min后，黃曲霉毒素降解率高達95%以上。此套設備如圖2所示，將AFB1超標的花生油從儲油罐中進入AFB1降解設備，經(jīng)過紫外照射后的花生油經(jīng)回流罐回流入原儲油罐，若檢測合格，則調(diào)整閥門流入成品罐。

圖2 紫外照射裝置

除此之外，廣東省糧食科學研究所研制的LZB15型紫外光照去除黃曲霉毒素設備，能耗低、處理費用小、勞動強度低，累計處理了1 670 t花生油，效果良好[39]。目前，有好多設備廠已經(jīng)研制出黃曲霉毒素降解設備，設備大多采用紫外照射法，去除率高達90%以上[40]。

5.3 臭氧降解法

國內(nèi)外對臭氧降解法去除黃曲霉毒素做了許多研究，通過對臭氧濃度、處理時間等一些參數(shù)的調(diào)節(jié)，毒素可有效降解[41-42]。臭氧去除發(fā)霉飼料工藝操作簡單，投資小，所以許多飼料廠采用臭氧發(fā)生裝置來達到大規(guī)模去除黃曲霉毒素的效果。山長坡等[43]為了高效降解花生中黃曲霉毒素，研制了一套臭氧降解黃曲霉毒素的設備，如圖3所示。這套設備采用耐腐蝕不銹鋼的材質(zhì)制成，由臭氧發(fā)生器、臭氧運輸系統(tǒng)、花生脫毒罐等構成，在室溫下，當臭氧濃度89 mg/l，臭氧流速為1 L/min，攪拌速度70 r/min，臭氧相對濕度50%，處理時間30 min時，此時，花生中AFB1降解率為82.6%。

圖3 花生臭氧脫毒裝置

除此之外，還存在一種臭氧脫毒裝置，沒有臭氧發(fā)生裝置，但是有一個臭氧熏蒸室，發(fā)霉飼料先放入熏蒸室中，通入一定濃度的臭氧后，熏蒸一定時間，黃曲霉毒素可得到有效去除（圖4）。研究表明，在此裝置中通入濃度為6 mg/l,熏蒸半個小時后，AFB1最大的降解率達到66%[44]。

圖4 臭氧熏蒸裝置

5.4 三種工程化設備比較分析

上述三種工程化設備適用于不同的原料，各有優(yōu)缺點，如表1所示。

表1 三種設備對比分析

色選機主要是挑選不合格的糧食原料，不管是霉變、長黃斑、空殼的糧食都可以去除，對于去除霉變糧食沒有專一性。其設備要求簡單，占用場地面積小，但是其存在工作效率低，毒素去除效果不顯著的缺點。色選機在碾米廠和面粉廠被大規(guī)模應用，不僅可以有效地剔除發(fā)霉糧食，而且工藝簡單，易于得到推廣。

食用油的生產(chǎn)過程中，黃曲霉毒素超標事件常常發(fā)生，所以在食用油生產(chǎn)流水線上常安裝一套紫外照射裝置，分解黃曲霉毒素。這套裝置可以實現(xiàn)連續(xù)性去除黃曲霉毒素，且效率高，設備能耗低，同時紫外照射還會起到殺菌的作用，不足的是，紫外照射花生油后，會對花生油的品質(zhì)造成破壞，損壞不飽和脂肪酸，且使花生油產(chǎn)生大量自由基，進而導致油脂更易變質(zhì)[45]。

臭氧脫毒裝置一般應用于發(fā)霉飼料廠或食品加工業(yè)中，該裝置需要不銹鋼抗氧化性好的材料制成，為了去除均勻，脫毒罐中安裝了攪拌器，所以設備成本相比前兩種要高，但是其自動化程度高，勞動強度小，解毒效果明顯，被人們廣泛應用。

6 結束語

一直以來，黃曲霉毒素污染問題被人類廣泛關注。目前，已經(jīng)有大量文獻報道了如何去除黃曲霉毒素，其中物理方法操作簡單，對物質(zhì)的營養(yǎng)成分破壞小，被人們廣泛利用，走上了工業(yè)化。色選機的發(fā)明和紫外照射裝置的出現(xiàn)，實現(xiàn)了大規(guī)模的降解黃曲霉毒素，效果較好，這兩種設備在面粉廠和食用油加工廠中較為常見?；瘜W法所用的試劑會對營養(yǎng)物質(zhì)造成破壞，處理后飼料的適口性會變差，而且有的成本太高，不利于工業(yè)化使用，只有臭氧解毒方法實現(xiàn)了工業(yè)化。生物解毒方法是目前最有前景的解毒方法，其環(huán)保無污染，而且高效，但是無法實現(xiàn)工業(yè)化。對于解毒方法的研究，大多數(shù)是處于實驗室水平，有的雖然很高效，但是很難擴大化，這就需要以后的研究者們，可以根據(jù)實際生產(chǎn)情況，研究出更加經(jīng)濟又實用的方法，走向工業(yè)化。