基于高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜的寡糖輪廓分析用于蜂蜜中淀粉糖漿的摻假鑒別研究

張 睿，劉 蕓*，丁 濤，吳 斌，沈崇鈺，費曉慶，桂茜雯，王 艷，郭 玲，季美泉，王栩璐，鄧曉軍，郭德華

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135)

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基于高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜的寡糖輪廓分析用于蜂蜜中淀粉糖漿的摻假鑒別研究

張 睿1，劉 蕓1*，丁 濤1，吳 斌1，沈崇鈺1，費曉慶1，桂茜雯1，王 艷1，郭 玲1，季美泉1，王栩璐1，鄧曉軍2，郭德華2

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135)

采用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜(HPLC-Q/Orbitrap MS)建立了寡糖輪廓分析的方法。通過對純天然蜂蜜和淀粉類糖漿中的麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖進行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)淀粉類糖漿中含有未被酶解完全的微量麥芽類寡糖，且麥芽七糖在所有檢測樣本中干擾小，對結(jié)果的定量無影響，而其他寡糖類物質(zhì)的定性和定量結(jié)果會存在干擾。最終選擇麥芽七糖作為蜂蜜中摻入淀粉糖漿的典型標(biāo)志物。在實際樣品分析中，根據(jù)麥芽七糖的保留時間和離子對的相對豐度比可以定性判斷蜂蜜中是否摻有淀粉糖漿；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以定量測定樣液中麥芽七糖的含量。在20，50，100 mg/kg 3個加標(biāo)水平下，麥芽七糖的平均回收率為75%～82%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為3.1%～6.7%，方法檢出限為0.1 μg/mL。應(yīng)用該方法可在10 min內(nèi)完成整個分析過程，且樣品前處理簡單，結(jié)果可靠，靈敏度高，可用于純天然蜂蜜中摻入淀粉糖漿的快速確證和檢測。

蜂蜜摻假；寡糖輪廓分析；高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜

蜂蜜具有較高的營養(yǎng)價值和獨有的芳香氣味，因此，比其他甜味食品具有更高的價格。有些不法生產(chǎn)者為了獲得更多的經(jīng)濟利益，而在純天然蜂蜜中摻入其他糖類物質(zhì)，消費者很難辨別真假。純天然蜂蜜中摻入淀粉類糖漿(大米糖漿、玉米糖漿)是蜂蜜摻假中普遍存在的一種現(xiàn)象[1-2]。淀粉糖漿是紅薯、玉米等植物淀粉通過水解、脫色等工業(yè)手段加工而成的粘稠液體，其糖分組成為葡萄糖、低聚糖等[3-4]。淀粉的水解在工業(yè)上稱為轉(zhuǎn)化，淀粉糖漿轉(zhuǎn)化過程中通過采用不同的酸、酶或酸酶合并的工藝可以控制轉(zhuǎn)化的葡萄糖和果糖的比例，可以與蜂蜜極為相似，從而達到以假亂真的程度。與天然蜂蜜相比，淀粉糖漿的價格卻極為低廉。

針對蜂蜜中淀粉類糖漿的鑒定，現(xiàn)有的檢測方法有穩(wěn)定碳同位素法[5-7]、薄層色譜法[8-9]、離子色譜法[10-11]和氣相色譜法[12-13]等。但現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)方法在鑒定蜂蜜中的淀粉類糖漿時存在一定的缺陷，如穩(wěn)定碳同位素法無法檢測大米糖漿等C3植物糖漿的摻假；薄層色譜法測試樣品的周期較長，且需檢驗員人為地通過比對顏色的深淺判斷結(jié)果，客觀性較大，易造成較大的偏差；離子色譜法則需測定蜂蜜中的寡糖從而判斷蜂蜜中是否摻入淀粉類糖漿，其樣品首先需要除去蜂蜜中的單糖，然后富集寡糖進行分析，前處理相當(dāng)復(fù)雜，且離子色譜法的分析時間較長，分離度和靈敏度均較低，由于蜂蜜基質(zhì)中雜質(zhì)干擾較多，使得測定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。因此很有必要建立能夠高通量、簡單、快速、高靈敏度和高準(zhǔn)確度的方法篩查蜂蜜中是否摻入淀粉類糖漿。

本研究通過對純天然蜂蜜和糖漿中的寡糖輪廓進行分析，以期找出靈敏的標(biāo)志物用于準(zhǔn)確判斷蜂蜜中是否摻入淀粉類糖漿。但在寡糖輪廓分析的測定中存在幾個問題：寡糖在蜂蜜中含量較低，且存在結(jié)構(gòu)相似的碳水化合物和其它大量單糖的干擾。本研究所采用的高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，具有高靈敏度和強抗干擾能力的優(yōu)勢[14-16]，蜂蜜樣品經(jīng)過簡單的前處理后，直接對其中的寡糖輪廓進行分析，從而找到蜂蜜中摻入淀粉類糖漿的典型寡糖標(biāo)記物。本方法具有前處理過程簡便、分析時間短、測定結(jié)果準(zhǔn)確等特點，可以準(zhǔn)確、快速地判斷蜂蜜中是否摻入淀粉糖漿。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖(純度均大于99.9%，Aldrich-Sigma公司);乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；乙腈、甲酸(色譜純，德國Merck公司)。

四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive(賽默飛世爾科技ThermoFisher Scientific公司)，配備有HESI-Ⅱ源，液相色譜系統(tǒng)為Dionex Ultimate 3000高壓液相色譜，自動進樣器；X Calibur 2.2 軟件用于儀器控制；Q Exactive(Tune)2.1 軟件用于質(zhì)譜控制，LC quanTM2.7軟件用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。所有實驗用水均來自Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國)；XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；高速離心機(德國Sigma公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取一定量的寡糖標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封保存于4 ℃冰箱中。分別精密量取上述5種單標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用乙腈-水(1∶1)稀釋成5個標(biāo)準(zhǔn)濃度的工作溶液，于4 ℃冰箱中貯存，用于液相色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化。

1.3 樣品前處理

對無結(jié)晶的蜂蜜和糖漿樣品，將其攪拌均勻，對有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過60 ℃的水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫。準(zhǔn)確稱取融化后的樣品1.0 g(精確至0.01 g)置于適當(dāng)刻度容器中，用水定容至10.0 mL，渦旋至溶解，適量上層清液與等體積乙腈混合均勻后，取混合溶液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾至進樣瓶中，供高效液相-四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀測定。

1.4 實驗條件

色譜條件：色譜柱為Carbohydrate色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序為：0～2 min,35% A；2～2.5 min，35%～50% A；2.5～8.0 min，50% A；8.0～9.0 min，50%～35% A；9.0～12.0 min，35%A。流速：1.20 mL/min；進樣量：25 μL；樣品室溫度：25 ℃。

質(zhì)譜條件：可加熱的電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)；毛細管溫度為350 ℃，加熱溫度為320 ℃，鞘氣(N2)流速50 psi，輔助氣(N2)流速6 psi，吹掃氣(N2)流速3 psi；噴霧電壓為3 kV，透鏡電壓為50 V；采用正離子掃描的Target-MS2模式；Target-MS2掃描中分辨率R=17 500；AGC target：2×105；最大駐留時間：100 ms；分辨率：70 000；分離窗口：2.0m/z；強度閾值：4×104。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

由于本研究是分析蜂蜜中的寡糖類化合物，寡糖類物質(zhì)為高極性、多羥基類化合物，因此選擇對大極性物質(zhì)保留較好的色譜柱進行比較。以水和乙腈為流動相，分別對比了Agilent Carbohydrate柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)、Phenomenex NH2柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)和Agilent HILIC Plus(2.1 mm×100 mm，3.5 μm) 3種色譜柱對寡糖的分離能力。結(jié)果表明，在相同的液相色譜條件下，寡糖類物質(zhì)在3種色譜柱上均有較好的保留，但Phenomenex NH2柱和HP Amide柱的耐用性相對較差，大批量樣品分析后寡糖的色譜峰形和保留時間重現(xiàn)性下降，定性和定量準(zhǔn)確性降低。因此，最終嘗試Carbohydrate柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)作為分析色譜柱。由于寡糖類化合物的極性均較強，首先采用乙腈-水流動相進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)寡糖類物質(zhì)色譜峰峰形拖尾。進而采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.1 %甲酸作為流動相來優(yōu)化寡糖分離條件。當(dāng)流動相中加入適量乙酸銨溶液時，能夠增強寡糖類物質(zhì)在色譜柱上的保留，但峰形會拖尾；當(dāng)流動相中加入少量甲酸時，寡糖的保留時間有所減弱但峰形更對稱，正離子化效率明顯增強，檢測靈敏度提高，因此最終選用乙腈-0.1%甲酸作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過流動注射方式(FIA)將5種寡糖類標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入質(zhì)譜儀，對寡糖標(biāo)準(zhǔn)品進行全掃描檢測，從而得到一級質(zhì)譜圖和準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子峰分別為[M+H]+和[M+Na]+，用準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)提取目標(biāo)化合物的譜峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)[M+Na]+的信號響應(yīng)值高于[M+H]+峰，最終選擇[M+Na]+作為目標(biāo)化合物的母離子進行分析，其準(zhǔn)確分子質(zhì)量如表1所示。實際分子量與理論分子質(zhì)量偏差均小于5 ppm，表明Q-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜在理論質(zhì)量數(shù)和實驗質(zhì)量數(shù)之間可以提供高的可信度。

采用Target-MS2模式進行分析，碰撞能量設(shè)置為30 eV，由Orbitrap質(zhì)量分析器檢測碎片離子，選取信號強度最強的兩個離子碎片作為定性和定量離子。為得到寡糖類目標(biāo)物的最高儀器響應(yīng)值，基于所分析物質(zhì)的色譜峰形，進行了質(zhì)譜參數(shù)分辨率的優(yōu)化。實驗結(jié)果表明，在質(zhì)量窗口設(shè)置為5 ppm 內(nèi)，分辨率70 000為最佳的分析條件。最終優(yōu)化后的母離子、定性和定量離子見表1?；谏鲜錾V質(zhì)譜條件，麥芽三、四、五、六和七糖的提取離子流色譜圖如圖1A所示。

表1 麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖的質(zhì)譜信息

*quantitative ion

2.3 蜂蜜和糖漿中寡糖的結(jié)果分析

純天然蜂蜜的主要成分為葡萄糖、果糖和少量蔗糖，而摻假蜂蜜常使用淀粉類糖漿如大米糖漿和玉米糖漿，由于生產(chǎn)工藝的問題，會存在未水解完全的麥芽類寡糖，因此當(dāng)天然蜂蜜中摻入淀粉類糖漿時，會有痕量的麥芽類寡糖存在。在檢測分析時，麥芽類寡糖可作為摻假蜂蜜的特種標(biāo)志物。采用上述優(yōu)化的液相色譜-質(zhì)譜條件，對純天然蜂蜜、大米及玉米糖漿中的麥芽類寡糖進行檢測。純天然蜂蜜的提取離子流色譜圖如圖1B所示。

2.3.1 淀粉類糖漿中寡糖的檢測分析 對實驗室收集的10種大米糖漿和2種玉米糖漿，按照“1.3”的樣品前處理步驟和“1.4”的實驗條件進行分析。結(jié)果如表2所示，大米和玉米糖漿中麥芽三、四、五、六和七糖均有檢出，其含量約在900～8 000 mg/kg之間，由于工藝中酶解溫度、時間均會對淀粉糖漿生產(chǎn)過程中殘留的麥芽寡糖含量產(chǎn)生影響，因此其含量在不同生產(chǎn)工藝和不同類型的淀粉類糖漿中并無規(guī)律性的趨勢和變化。

表2 大米糖漿和玉米糖漿中寡糖的含量分布(mg/kg)

2.3.2 純天然蜂蜜中寡糖的檢測分析 對來自新疆、內(nèi)蒙、河南、江蘇、山東、遼寧、四川、吉林、陜西、湖北和河北等地的油菜、洋槐、椴樹、荊條和葵花共93個天然蜂蜜樣本進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述天然蜂蜜中存在一些糖類的干擾物質(zhì)，對麥芽三糖、四糖、五糖和六糖的定性和定量存在干擾，因此麥芽三糖、四糖、五糖和六糖無法作為是否摻入淀粉類糖漿的標(biāo)志性物質(zhì)進行定性和定量分析，而麥芽七糖在所有檢測蜂蜜樣本中干擾最小，對結(jié)果的定量分析基本無影響，因此實驗最終選擇麥芽七糖作為蜂蜜中外源性淀粉糖漿摻假鑒別的指標(biāo)。

2.4 方法學(xué)的考察

2.4.1 線性范圍及檢出限 配制麥芽七糖的質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10，20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化實驗條件進行測定，外標(biāo)法定量。以麥芽七糖特征離子的質(zhì)量色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，在0.5～20 μg/mL范圍內(nèi)，麥芽七糖的濃度與響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=7.98×104x+2.67×102，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999。在空白天然蜂蜜樣品中添加低濃度的目標(biāo)化合物，麥芽七糖的檢出限(S/N=3)為0.1 μg/mL，定量下限(S/N=10)為0.3 μg/mL。

2.4.2 回收率與精密度 在空白的天然油菜蜜、洋槐蜜和椴樹蜜3種蜂蜜樣品中添加麥芽七糖(20，50,100 mg/kg)標(biāo)準(zhǔn)溶液進行添加回收和精密度實驗，每個水平制備9個平行樣，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，3種蜂蜜在3個水平的加標(biāo)回收率為75%～82%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為3.1%～6.7%。說明該方法對不同品種和類型的蜂蜜樣品均能夠達到蜂蜜摻假鑒別的分析要求。

表3 3種蜂蜜中麥芽七糖的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5 實際蜂蜜樣品摻入淀粉類糖漿的檢測

采用上述高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜方法，通過對大量不同蜜種和不同產(chǎn)地蜂蜜中麥芽七糖含量的分析，發(fā)現(xiàn)有些蜂蜜會有微量麥芽七糖。在大量樣本的基礎(chǔ)上，同時結(jié)合儀器的檢出限，確定該方法的判定限為3 μg/mL，設(shè)定為此濃度水平時不會導(dǎo)致假陽性。測定了實驗室日常送檢和抽檢的50個蜂蜜樣品，其中包括成熟蜂蜜和非成熟蜂蜜、單花蜜和多花蜜及不同蜜種和產(chǎn)地的蜂蜜。檢出含有麥芽七糖的樣品有32批，占64.0%?？梢姺涿壑蟹欠ㄌ砑拥矸厶菨{的現(xiàn)象普遍存在，該方法可有效檢出蜂蜜中是否摻有淀粉類糖漿。

3 結(jié) 論

本文針對目前造假蜂蜜中普遍使用淀粉類糖漿，以及缺乏準(zhǔn)確和有效的檢測方法，難以對市場進行有效監(jiān)管的問題，建立了高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用的寡糖輪廓分析方法，通過測定淀粉類糖漿中未被酶解完全的微量麥芽類寡糖，從而找到了以麥芽七糖作為蜂蜜中摻入淀粉糖漿的標(biāo)志物。樣品經(jīng)提取溶劑提取后直接進樣測定，避免了復(fù)雜的前處理過程，應(yīng)用本方法可在10 min內(nèi)完成整個檢測過程，大大提高了檢測效率。在實際樣品分析中，根據(jù)麥芽七糖的保留時間和離子對的相對豐度比可以定性判斷蜂蜜中是否摻有淀粉糖漿，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以定量測定樣液中麥芽七糖的含量。該方法完整性強、專屬性好、可控性強、準(zhǔn)確性高，可用于蜂蜜中淀粉糖漿的快速鑒別檢測。

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Identification of Starch Syrup in Honey Adulteration Based on Oligosaccharide Profiling Test by High Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Electrostatic Field Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

ZHANG Rui1，LIU Yun1*，DING Tao1，WU Bin1，SHEN Chong-yu1，F(xiàn)EI Xiao-qing1，GUI Qian-wen1，WANG Yan1，GUO Ling1，JI Mei-quan1，WANG Xu-lu1，DENG Xiao-jun2，GUO De-hua2

(1.Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China；2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China)

A method of oligosaccharide profiling test was developed based on high performance liquid chromatography-quadrurpole/ electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry(HPLC-Q/Orbitrap MS).Through qualitative and quantitative analysis of maltotriose，maltotetraose，maltopentaose，maltohexaose and maltoheptaose in pure natural honey and starch syrup，trace of malt oligosaccharides that was not totally enzymatic hydrolyzed were found in starch syrup.Furthermore，the interference of maltoheptaose in all test samples was the smallest and had no impact on the quantitative analysis results.While，the qualitative or quantitative analysis of other oligosaccharides were interfered more or less.In the analysis of real samples，the starch syrup in honey adulteration could be judged by the retention time and relative abundance ratio of maltoheptaose，therefore the content of maltoheptaose in sample solution could be quantitatively determined through standard curve method.By adding standard test，the average recoveries of maltoheptaose at three spiked levels of 20，50 and 100 mg/kg were in the range of 75%-82% with relative standard deviations(RSD，n=5) of 3.1%-6.7%.The detection limit of this method was 0.1 μg/mL.The whole analysis time could be limited in 10 min.The method had the advantages of simple processing procedure，high accuracy，reliability，sensitivity，therefore it could be applied in the rapid detection of starch syrup in honey.

honey adulteration;oligosaccharide profiling test;high performance liquid chromatography-quadrurpole/electrostatic field Orbitrap high resolution mass spectrometry

2016-05-27；

2016-07-20

江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃(2016KJ05)；上海長三角科技合作項目(15395810100)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.020

O657.63;S896.1

A

1004-4957(2016)12-1628-06

*通訊作者：劉 蕓，博士，高級工程師，研究方向：食品質(zhì)量控制和摻假鑒別，Tel：025-52345183，E-mail:liuy4@jsciq.gov.cn