UPLC-Q-TOF-MS法測定小鼠大腦中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量

區(qū)碩俊，羅展遠，曾廣豐，梁俊發(fā)，章海濤，梁衛(wèi)寰，岑建斌，徐穎愉

(1.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，廣東 廣州 511447；2.廣東藥學(xué)院 廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心，廣東 廣州 510006；3.廣東出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；4．廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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UPLC-Q-TOF-MS法測定小鼠大腦中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量

區(qū)碩俊1,3*，羅展遠2，曾廣豐3，梁俊發(fā)1，章海濤3，梁衛(wèi)寰4，岑建斌1，徐穎愉1

(1.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，廣東 廣州 511447；2.廣東藥學(xué)院 廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心，廣東 廣州 510006；3.廣東出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；4．廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)對小鼠大腦中的多巴胺(DA)、5-羥色氨(5-HT)、二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA) 4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量進行同時測定。樣品以30%乙醇溶液(甲酸調(diào)至pH 5.0)勻漿處理后，冷凍離心，過濾。在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件下，采用ESI和APCI復(fù)合源，正/負離子掃描方式進行數(shù)據(jù)采集。4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在0.5～1 000 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.999 3，方法的檢出限為0.5～5.0 μg/L，平均回收率為93.3%～101.8%，相對標準偏差為1.1%～3.3%。該方法具有操作簡便、高效快速、回收率良好、靈敏度高、重現(xiàn)性好和準確度高等優(yōu)點，可用于小鼠腦組織內(nèi)4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量測定。

超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；小鼠；腦組織

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(Monoamine neurotransmitters，MNTs)是人體內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在人體內(nèi)的神經(jīng)、心血管等組織系統(tǒng)及激素介導(dǎo)的內(nèi)外分泌活動中有著廣泛的調(diào)節(jié)作用[1]。MNTs及其代謝產(chǎn)物的含量對情緒、認知和應(yīng)激行為等生理活動均有重要影響[2-4]，同時，其含量變化與人類多種精神疾病的臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，如抑郁癥[5]、焦慮癥[6]、精神分裂癥等[7]。因此，準確檢測生物體內(nèi)的MNTs對于人類疾病的診斷、藥物治療及基礎(chǔ)研究具有重要意義[8]。

由于MNTs在生物樣品中的含量極低，增加MNTs在反相色譜中的憎水性困難較大，以及基質(zhì)效應(yīng)等因素的干擾，因此，準確測定MNTs仍具有挑戰(zhàn)性。目前，有關(guān)MNTs的檢測方法主要有液相色譜法(包括高效液相色譜-激光誘導(dǎo)熒光法[9]、高效液相色譜-電化學(xué)檢測法[10])、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-12]、熒光法[13]和毛細管電泳法[14]。上述方法中，電化學(xué)檢測法存在穩(wěn)定性差、靈敏度低、難度高和檢測速度慢等問題，而毛細管電泳法則重現(xiàn)性較差，因此，這2種方法不適用于臨床診斷。而高效液相色譜-熒光法雖解決了上述問題，但由于其選擇性仍難達到分析要求，對于生物樣品來說易受雜峰干擾，從而影響分析結(jié)果，并且為了改善目標物在色譜柱中的保留行為，需在流動相中加入離子對試劑，從而大大縮短了色譜柱壽命，因此不適于批量檢測。柱前衍生化處理結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)可以顯著提高檢測的靈敏度，并降低生物樣品的基質(zhì)效應(yīng)[15-16]。但柱前衍生化的操作較繁瑣，總體的衍生時間較長，而且同一種衍生劑對不同的MNTs衍生時間也不一致(30～120 min)。本文采用乙醇-甲酸作為萃取劑，無需對生物樣品進行衍生處理，縮短了樣品前處理時間，并結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS精確測定分子量，建立同時測定生物體內(nèi)4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的UPLC-Q-TOF-MS法，該方法相比于直接測定的LC-MS法提高了定性、定量能力。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

Triple TOF?5600+高分辨質(zhì)譜儀(美國ABsciex公司)，UPLC 20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)。T10 basic勻漿機(德國IKA公司)；PHS-25CW pH計(上海般特儀器有限公司)；TG16B 離心機(湖南凱達科學(xué)儀器有限公司)；D3024R冷凍高速臺式離心機(美國賽洛捷克Scilogex公司)；CSR-1-200超純化水機(北京愛思泰克科技開發(fā)有限責任公司)。

1.2 材料與試劑

飼養(yǎng)7 d昆明小鼠，體重范圍28～35 g(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心)；無水乙醇、甲酸(分析純，廣州試劑廠)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)標準品(純度≥ 99%，美國Sigma公司)；實驗用水為超純水。

1.3 實驗條件

1.3.1 標準溶液的配制 分別準確稱取4種神經(jīng)遞質(zhì)標準品各0.010 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用30%甲醇溶液定容配制成100 mg/L儲備液，然后吸取上述4種標準儲備液用30%甲醇溶液稀釋配成混合標準系列溶液，各單標濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0，25.0，50.0，250，500，1 000 μg/L。

1.3.2 樣品處理 在低溫手術(shù)臺上取小鼠大腦的不同腦組織部位于-20 ℃保存，稱重，置于2 mL離心管中，按腦組織∶組織提取液(30%乙醇，甲酸調(diào)至pH 5.0)=1 g∶10 mL的比例加入組織提取液，將離心管置于冰浴中用勻漿機勻漿1 min。取出后冷凍離心20 min(15 000 r/min，2 ℃)，上清液過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Cortecs C18(100 mm×3.0 mm，2.7 μm，Waters公司)；柱溫：35 ℃；樣品室溫度20 ℃；進樣量：5 μL；流動相A為甲醇，B為水，采用梯度洗脫方式洗脫分離；流速：0.5 mL /min。正離子模式梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，10%～80% A；3.0～5.0 min，80% A；5.0～5.1 min，80%～10% A；5.1～6.0 min，10% A。負離子模式梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，40%～95% A；3.0～5.0 min，95% A；5.0～5.1 min，95%～40% A；5.1～6.0 min，40% A。

1.3.4 質(zhì)譜條件 離子源：ESI和APCI復(fù)合源(ESI為化合物測定離子源，APCI為校準離子源)；正/負離子掃描方式；APCI源連接ABsciex公司自動校正系統(tǒng)(CDS)，每10個樣品自動校正1次，APCI正離子校正液流速0.25 mL/min，APCI負離子校正液流速0.5 mL/min，氣簾氣：40 psi，離子源霧化氣：50 psi，離子源加熱輔助氣：50 psi，離子源溫度：550 ℃，離子源電壓5 500 V/-4 500 V。一級TOF-MS掃描準確質(zhì)量范圍：100～1 000 Da，數(shù)據(jù)采集時間100 ms，DP:40 V/-40 V，CE:5 V/-5 V；二級IDA-MS掃描準確質(zhì)量范圍：50～1 000 Da，DP:40 V/-40 V，CE:(15±10) V/(-15±10) V；高靈敏模式，數(shù)據(jù)采集時間50 ms，信號閾值100 cps，IDA實驗每循環(huán)采集6次數(shù)據(jù)，動態(tài)背景減法扣除。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法 所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)在ABSciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集，數(shù)據(jù)在PeakView 2.0，MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等軟件上定性定量處理分析。根據(jù)TOF-MS和IDA-MS高分辨質(zhì)譜獲得化合物的準確分子量，定性定量分析小鼠大腦中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的定性定量分析

采用UPLC-Q-TOF-MS檢測小鼠大腦中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，以目標物一級母離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、二級碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)和色譜保留時間等信息進行定性定量分析，4種目標化合物的定量分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。4種化合物中DOPAC和HVA僅在負離子模式下有響應(yīng)，形成[M-H]-分子離子峰；DA和5-HT在正離子和負離子模式下均有響應(yīng)，但正離子模式的分子離子峰[M+H]+強度大于[M-H]-。二級精確分子量質(zhì)譜見圖1。

表1 4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的定性定量分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖2 不同提取劑對4種神經(jīng)遞質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction agents on 4 kinds of monoamine neurotransmitters

圖3 pH值對4種神經(jīng)遞質(zhì)回收率的影響Fig.3 Effect of pH value on recoveries of four monoamine neurotransmitters

2.2 樣品處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的優(yōu)化 分別以濃度均為30%的甲醇、乙醇、乙腈、正丁醇作為提取劑，對樣品中的4種神經(jīng)遞質(zhì)進行萃取。結(jié)果顯示，4種提取劑具有較好的沉淀蛋白效果，其中以30%乙醇為提取劑時，對4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的回收率影響最小，提取效果最佳(見圖2)。

進一步考察了不同比例的乙醇溶液對4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的提取效果。由于4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)均具有較強的親水性，尤其是鹽酸多巴胺，只能在乙醇等有機溶劑中微溶。因此提取液中乙醇的比例不能過大，否則會導(dǎo)致提取率降低。實驗結(jié)果顯示，乙醇比例為30%時凈化效果更佳，因此選取30%的乙醇溶液作為提取液。

2.2.2 沉淀凈化條件的優(yōu)化 使用高氯酸作為蛋白質(zhì)沉淀劑雖然效果顯著，但由于其具有強氧化性，過高濃度的高氯酸會引起神經(jīng)遞質(zhì)氧化分解，從而影響分析結(jié)果，同時也會縮短色譜柱壽命。本實驗采用30%乙醇提取液作為蛋白質(zhì)沉淀劑，并用甲酸將溶液調(diào)至大腦蛋白質(zhì)的等電點附近。同時，考察了不同pH值對4種神經(jīng)遞質(zhì)回收率的影響。結(jié)果表明，pH值在4.0～6.0的范圍內(nèi)，溶液具有良好的凈化效果，而在pH值為5.0的條件下，4種神經(jīng)遞質(zhì)的回收率較高，滿足分析要求(見圖3)。

2.3 方法的專屬性

4種目標物按照表1的精確分子量提取一級母離子，并結(jié)合同位素豐度比、二級碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)和色譜保留時間進行測定。由于高分辨質(zhì)譜的高靈敏度，可極大地排除基質(zhì)干擾，為進一步考察基質(zhì)效應(yīng)，取6份同一樣本的腦組織紋狀體勻漿液各500 μL，1份勻漿液加入500 μL提取液作為對照；另5份加入4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的混合標準溶液100 μL，然后加入提取液 400 μL處理后進行分析。以相同濃度的標準溶液進行單點定量，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，4種目標物測定的準確度均大于95.2%，小鼠腦區(qū)中的其它內(nèi)源性物質(zhì)不影響4種目標物的測定。

表2 小鼠腦勻漿液中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定準確度(n=5)

2.4 線性關(guān)系與檢出限

精確吸取各標準儲備液并進行混合稀釋，得到一系列質(zhì)量濃度不同的混合標準溶液，在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件下進樣分析，以峰面積(Y)對進樣質(zhì)量濃度(X，μg/L)進行線性回歸。結(jié)果表明，4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的響應(yīng)值與其濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 3(見表3)。按3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=3)計算定量下限(LOQ)，得到4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的LOD為0.5～5.0 μg/L，LOQ為2.0～15.0 μg/L(見表3)，表明方法具有較高的靈敏度。

表3 4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

2.5 回收率與精密度

在已知各單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度的同一紋狀體勻漿液樣品中，添加3種不同水平的4種混合標準溶液，每個水平日內(nèi)重復(fù)測定6次，樣品的平均回收率和相對標準偏差(RSD)見表4。4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的平均回收率為93.3%～102%，相對標準偏差(RSD)為1.1%～3.3%，表明該方法的準確度與精密度滿足4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)分析的要求。

表4 小鼠腦勻漿液中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的加標回收率與相對標準偏差(n=6)

2.6 實際樣品分析

采用本方法分別對飼養(yǎng)7 d無異常行為的20只小鼠大腦的紋狀體進行處理分析，紋狀體和下丘腦組織中分別檢出DA，5-HT和DOPAC，未檢出HVA(結(jié)果見表5)，實際樣品的提取離子流色譜圖見圖4，說明該方法適用于實際樣品的檢測。

表5 小鼠大腦紋狀體組織中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量(μg/g)

圖4 實際樣品中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的提取離子流色譜圖

Fig.4 Extracted ion chromatograms of four monoamine neurotransmitters in actual samples

3 結(jié) 論

本文建立了UPLC-Q-TOF-MS同時測定小鼠大腦組織中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的方法。采用乙醇-甲酸溶液作為提取劑，簡化了樣品前處理過程；以甲醇-水作為流動相進行梯度洗脫，目標物在3 min內(nèi)可達到較好的分離，大大縮短了分析時間；利用高分辨質(zhì)譜的高靈敏度，減少了基質(zhì)對目標物的干擾，對于目標物的定性定量更為精確。運用本法對20只小鼠大腦紋狀體和下丘腦中的4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)進行測定，結(jié)果表明該方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好和準確度高等優(yōu)點，可用于小鼠腦組織中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定，從而為疾病的藥物治療及基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。

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Determination of Four Monoamine Neurotransmitters in the Mouse Brains by Ultra Performance Liquid Chromatography with High Resolution Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry

OU Shuo-jun1,3*，LUO Zhan-yuan2，ZENG Guang-feng3，LIANG Jun-fa1，ZHANG Hai-tao3，LIANG Wei-huan4，CEN Jian-bin1，XU Ying-yu1

(1.National Centre for Quality Supervison and Testing of Processed Food(Guangzhou)，Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 511447，China；2.Guangdong Province Research Centre for Chinese Integrative Medicine Against Metabolic Disease,Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006,China；3.Inspection & Quarantine Technology Center of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou 510623，China；4.School of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，China)

An ultra performance liquid chromatography-high resolution quadrupole time of flight mass spectrometric(UPLC-Q-TOF-MS) method was developed for the determination of four monoamine neurotransmitters including dopamine(DA)，serotonin hydrochloride(5-HT)，3,4-dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) and homovanillic acid(HVA) in mouse brains.Samples were homogenized with 30% ethanol solution(formic acid pH 5.0)，freezingly centrifuged and filtered.Under the optimized chromatographic and mass spectrometric conditions，data were acquisited with electrospray ionization(ESI) and atmospheric pressure chemical ionization(APCI) composite sources in positive ion/negative ion mode.The calibration curves of four monoamine neurotransmitters showed good linearities(r>0.999 3) within the concentration range of 0.5-1 000 μg/L.The limits of detection were in the range of 0.5-5.0 μg/L，and the average recoveries were 93.3%-101.8% with relative standard deviations(RSDs) of 1.1%-3.3%.This method showed the advantages of simplicity，efficiency，high recovery，good sensitivity and high precision，and was suitable for the determination of four monoamine neurotransmitters in brain tissue of mouse.

ultra performance liquid chromatography-high resolution quadrupole time of flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF-MS)；monoamine neurotransmitters；mouse；brain tissue

2016-06-18；

2016-07-20

廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項目(2016PZ17)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.009

O657.63;O623.731

A

1004-4957(2016)12-1569-06

*通訊作者：區(qū)碩俊,助理工程師，研究方向：氣、液相色譜分析及研究，Tel:020-84410935，E-mail:846476388@qq.com