固相萃取-氣相色譜法檢測血清中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的研究

段麗村，周建于，李佳欣，李鵬飛，徐 芳，王 琦

(昆明醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 昆明 650500)

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固相萃取-氣相色譜法檢測血清中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的研究

段麗村，周建于，李佳欣，李鵬飛，徐 芳，王 琦*

(昆明醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 昆明 650500)

建立了血清中DDTs和BHCs共8種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的固相萃取-氣相色譜檢測方法。樣品經(jīng)超聲酸化沉淀蛋白后，采用正己烷-丙酮(9∶1)經(jīng)Cleanert ODS C18N固相萃取小柱提取，F(xiàn)lorisil固相萃取小柱凈化，氮氣吹干，以500 μL正己烷定容，氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，方法的線性范圍2～200 ng/mL，相關(guān)系數(shù)(r)為0.996 4～0.999 0，檢出限(LOD) 為0.1～0.9 ng/mL，定量下限(LOQ)為0.4～3.0 ng/mL。8種農(nóng)藥的回收率為80.5%～112.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～7.9%。該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，適用于血清樣品中痕量有機(jī)氯農(nóng)藥的檢測。

血清；DDTs；BHCs；有機(jī)氯農(nóng)藥；固相萃取；氣相色譜

有機(jī)氯農(nóng)藥(OCPs) 具有高效、低成本、廣譜殺蟲等特點，在我國20世紀(jì)50年代之后大量使用。因其污染嚴(yán)重，在環(huán)境中的長期殘留性、生物蓄積性和高毒性等特征[1]，我國于1983年停產(chǎn)使用六六六、滴滴涕，但在很多曾施用有機(jī)氯農(nóng)藥的地方仍有大量殘留[2]。已有研究表明，DDT已進(jìn)入全球性的生物地球化學(xué)循環(huán)，成為世界各國關(guān)注的環(huán)境和健康問題[3]。截至2009年，已有約十余種有機(jī)氯農(nóng)藥被《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》列為典型的持久性污染物(Persistent organic pollutants，POPs)及優(yōu)先控制有機(jī)污染物加以控制[4-5]。

有機(jī)氯及其代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、脂溶性強(qiáng)、難降解，目前在環(huán)境和生物樣品中仍然可以檢測到有機(jī)氯農(nóng)藥[6-7]。該類化合物可通過消化道、呼吸道和皮膚吸收，分布到各組織和器官，在血液中幾乎全部與血漿蛋白結(jié)合[8-9]。因此，對生物樣品中有機(jī)氯農(nóng)藥進(jìn)行分析檢測是了解其在生物體內(nèi)暴露的基礎(chǔ)。對于一般人群的暴露研究，血液是較易獲得的樣本。由于有機(jī)氯及其代謝產(chǎn)物在人體血液中的含量大致與其接觸量成正比關(guān)系,因此，檢測人體血液中的有機(jī)氯含量可以反映人群暴露于污染物的水平。

血清中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的分析，國外通常采用固相萃取法進(jìn)行提取和凈化，GC-MS檢測，且常與其它鹵代有機(jī)物如多氯聯(lián)苯(PCBs)、多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)等同時檢測[10]；而六六六(Hexachlorocyclohexane，BHC) 和DDT(Dichlorodiphenyltrichloroethane) 的測定大多采用電子捕獲檢測器檢測的氣相色譜法，國內(nèi)對該方面的研究較少，一般用液液萃取提取待測物，再用濃硫酸或濃硫酸與Florisil柱聯(lián)用凈化，氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)分析定量[11]。電子捕獲檢測器雖在定性能力上弱于質(zhì)譜，但對于有機(jī)氯的檢測靈敏度與MS相當(dāng)，也是分析含氯化合物的常用檢測器。本研究以人血清中BHC 4種異構(gòu)體和DDT及其主要代謝產(chǎn)物為研究對象，建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法，為人群有機(jī)氯暴露水平調(diào)查以及評價有機(jī)氯農(nóng)藥污染與人群健康的關(guān)系提供了可靠的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀配電子捕獲檢測器(ECD，Varian CP-3800美國瓦里安公司)；Rtx-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Restek公司)；DG-12D固相萃取裝置(12孔，上海皓莊儀器有限公司)；WH-1微型渦旋混合儀(上海瀘西分析儀器廠)；KQ3200超聲波清洗儀(科橋超聲波設(shè)備有限公司)；氮吹儀(上海濟(jì)成分析儀器公司)。

α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC，p,p′-DDE，p,p′-DDD，o,p′-DDT，p,p′-DDT 8種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所)；甲醇、二氯甲烷、甲酸(分析純，北京化學(xué)試劑廠)；無水硫酸鈉(分析純，天津化學(xué)試劑廠)；正己烷(色譜純，德國Merk公司)；高純N2(純度>99.999%，昆明梅塞爾氣體有限公司)；ODS C18N柱、Florisil柱(均為500 mg/3 mL，天津博納艾杰爾公司)；Silica柱(500 mg/3 mL，北京迪馬科技有限公司)。

1.2 溶液的配制

8種有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度為100 μg/mL，用正己烷配成10 μg/mL的混標(biāo)儲備液，使用前稀釋至1.00 μg/mL，貯存于4 ℃冰箱。無水硫酸鈉使用前在馬弗爐中450 ℃灼燒4 h。

1.3 色譜條件

進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度310 ℃，載氣為高純氮氣，流速1 mL/min，尾吹30 mL/min，不分流模式進(jìn)樣量1 μL。毛細(xì)管色譜柱升溫程序：100 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以 4 ℃/min升至250 ℃，保持1 min，共26.5 min。

1.4 樣品采集與制備

選取昆明市呈貢區(qū)雨花村和烏龍村50～70歲男性居民，抽取空腹靜脈血，靜置30 min，3 500 r/min離心10 min，取上層血清，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。預(yù)實驗選用混合血清進(jìn)行。

1.5 樣品前處理過程

1.5.1 沉淀蛋白 血清樣品室溫解凍，取1 mL于10 mL離心管中，加純水1 mL，渦旋2 min混勻，加入甲酸0.5 mL并渦旋2 min，超聲20 min酸化沉淀蛋白。

1.5.2 提 取 Cleanert ODS C18N固相萃取小柱的活化過程：先用5 mL二氯甲烷淋洗，再加入8 mL甲醇淋洗，8 mL純水平衡，保持小柱不干。將沉淀蛋白質(zhì)的血清樣品加入活化好的C18柱，用10 mL純水沖洗去除雜質(zhì)，抽干柱中水分并在空氣中晾干30 min，待測物用10 mL正己烷-丙酮(9∶1)洗脫，控制流速為1～2 mL/min。

1.5.3 凈 化 將10 mL正己烷-丙酮(9∶1)洗脫液用氮氣吹干至3 mL，過裝有2 g無水Na2SO4的小漏斗并用1 mL正己烷沖洗。Florisil固相萃取小柱活化：加入8 mL正己烷-丙酮(9∶1)溶液沖洗柱子，保持小柱不干，將上述脫水的溶液加入已活化的小柱，收集流出液，并用6 mL正己烷-丙酮(9∶1)溶液淋洗小柱，合并濾液后，氮氣吹干溶液，用500 μL正己烷溶解，過0.45 μm濾膜，待GC檢測。

1.6 二甲基氯硅烷(DMCs)對襯管硅烷化處理

采用丙酮等有機(jī)溶劑將襯管清洗干凈、晾干后，用5% DMCs正己烷溶液浸泡過夜，取出用甲醇清洗2～3次，浸泡1 h后，取出晾干，干燥條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

本研究選取不含目標(biāo)待測物的混合血清樣品，每1 mL樣品加入25 μL濃度為1 μg/mL的8種有機(jī)氯農(nóng)藥混標(biāo)，重復(fù)3次，優(yōu)化樣品前處理條件。

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 有機(jī)氯農(nóng)藥屬于弱極性至中等極性的化合物，本實驗采用中等極性的Rtx-1701和Rtx-5兩種毛細(xì)管色譜柱對待測物進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)在不同色譜條件下，兩種色譜柱均能較好地分離8種待測有機(jī)氯農(nóng)藥。根據(jù)實驗室現(xiàn)有條件，采用Rtx-5色譜柱進(jìn)行分離。

2.1.2 載氣流速的選擇 載氣流量是影響待測物在色譜柱中分離效率的重要因素，載氣流量慢，各峰的分離度較好，但所用分析時間長；載氣流量較快，分析時間縮短，但分離度變差。實驗考察了柱流量為1 mL/min和2 mL/min 對分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)柱流量增大時，各待測物的保留時間提前，但o,p′-DDT與p,p′-DDD部分色譜峰重疊，不能達(dá)到完全分離。故選擇柱流量為1 mL/min，在該柱流量下，各待測物分離效果好。

2.1.3 襯管硅烷化處理 由于p,p′-DDT可能會在進(jìn)樣口分解為p,p′-DDE和p,p′-DDD，所以參照美國EPA8081B方法，檢測了一定數(shù)量的樣品后，按“1.6”方法對氣相色譜進(jìn)樣口襯管進(jìn)行清洗和硅烷化處理，更換進(jìn)樣墊，并將毛細(xì)管色譜柱連接進(jìn)樣口的一端截除一段。

2.2 沉淀蛋白

人血清中含有的脂肪酸、膽固醇、甘油三脂和蛋白質(zhì)易附著在色譜柱上，從而改變柱子的特性并降低柱壽命，同時其中的游離脂肪酸可能會干擾色譜測定。根據(jù)文獻(xiàn)報道，甲酸是沉淀這些脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的良好沉淀劑,故實驗采用甲酸作為沉淀劑。分別取1 mL血清，各加入甲酸0.2，0.5，1 mL沉淀蛋白，按操作步驟進(jìn)行處理和檢測，發(fā)現(xiàn)加入甲酸0.5 mL和1 mL時，雜峰明顯減少，且效果相當(dāng)，所以本實驗選擇加入0.5 mL甲酸沉淀血清中的蛋白質(zhì)。

2.3 提取條件的優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇 固相萃取是近年用于液體樣品前處理的新技術(shù)。當(dāng)液體中有機(jī)化合物通過合適的固相萃取柱時被富集,再用少量選擇性溶劑洗脫，因而固相萃取是同時完成萃取和濃縮有機(jī)污染物的有效方式[12-14]。該方法操作簡單、流程短，同時有機(jī)溶劑的用量較少，符合快速、高效、低污染的樣品前處理方法[14]。因此本實驗選擇固相萃取法對血清中有機(jī)氯農(nóng)藥進(jìn)行提取。

C18材料的作用基團(tuán)是十八烷基，對非極性、弱極性和中等極性化合物具有廣泛保留，是目前固相萃取中應(yīng)用最廣的吸附劑。C18-N是硅膠鍵合C18后未進(jìn)行封端處理的反相柱，作用基團(tuán)為十八烷基和硅羥基，對極性化合物的保留增強(qiáng)。根據(jù)待測物的理化性質(zhì)和樣品基質(zhì)的特點，選擇對待測物有較強(qiáng)保留能力的C18反相填料作為固定相進(jìn)行萃取。

2.3.2 洗脫溶劑的選擇 由于有機(jī)氯農(nóng)藥屬于弱極性至中等極性的化合物，實驗考察了正己烷、正己烷-二氯甲烷(9∶1)、正己烷-丙酮(9∶1) 3種溶劑體系對待測物的洗脫效果。各取純水1 mL，按樣品前處理步驟，沉淀蛋白，過C18柱，分別用上述3種溶劑15 mL對待測農(nóng)藥進(jìn)行淋洗。結(jié)果顯示，正己烷、正己烷-丙酮(9∶1)作為洗脫溶劑時8種有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率相對較高。

進(jìn)一步考察了洗脫溶劑正己烷及正己烷-丙酮(9∶1)用量的影響。用12 mL該溶劑進(jìn)行淋洗，每收集2 mL作為1份，進(jìn)行洗脫曲線的制作。結(jié)果顯示，以正己烷作為洗脫溶劑時，需加入15 mL才能將δ-BHC洗脫完全，而正己烷-丙酮(9∶1)只需10 mL則可將8種目標(biāo)農(nóng)藥洗脫完全，所以實驗采用10 mL正己烷-丙酮(9∶1)作為最佳洗脫溶劑。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

2.4.1 固相萃取柱的選擇 采用“1.5”方法分別對Florisil柱和Si柱進(jìn)行活化，上樣，收集流出液，采用正己烷、正己烷-丙酮(9∶1)、正己烷-二氯甲烷(1∶1)各20 mL進(jìn)行淋洗，過0.45 μm濾膜，GC檢測。結(jié)果表明，采用正己烷-丙酮(9∶1)作為洗脫溶劑，F(xiàn)lorisil柱與Si柱的凈化效果相當(dāng)，但Si柱凈化后雜峰相對較多，考慮到后續(xù)將對多個血清樣品進(jìn)行檢測，本實驗采用Florisil柱對血清樣品進(jìn)行凈化。

2.4.2 洗脫溶劑體積的選擇 用Florisil柱凈化，正己烷-丙酮(9∶1)為洗脫溶劑，對洗脫所需體積進(jìn)行考察。用6 mL該溶劑進(jìn)行淋洗，每收集1 mL作為1份，共6份進(jìn)行洗脫曲線的制作。結(jié)果顯示，前5 mL洗脫液可以洗脫大部分農(nóng)藥，為確保待測物洗脫完全，實驗選擇正己烷-丙酮(9∶1)的最佳用量為6 mL，且采用的流速為小柱自然流速，以便洗脫液與待測物充分接觸。

2.5 方法評價

2.5.1 線性范圍、檢出限及定量下限 配制不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳色譜條件下，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X,ng/mL)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結(jié)果如表1所示，方法的線性范圍2～200 ng/mL，相關(guān)系數(shù)(r)為0.996 4～0.999 0，LOD為0.1～0.9 ng/mL，LOQ為0.4～3.0 ng/mL。

表1 方法的特征參數(shù)

2.5.2 回收率與精密度 在空白血清樣品中分別加入5，20 ng/mL兩個濃度梯度的有機(jī)氯標(biāo)準(zhǔn)品，在最佳條件下進(jìn)行樣品前處理和檢測。結(jié)果如表2所示，8種農(nóng)藥的回收率為80.5%～112.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～7.9%。所建立的方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，能用于血清樣品中痕量有機(jī)氯農(nóng)藥的分析檢測。

表2 血清樣品的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.5.3 實際樣品的分析 將建立的方法用于調(diào)查對象血清中8種有機(jī)氯農(nóng)藥的檢測，圖1為5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和第56號樣品的色譜圖。對于標(biāo)準(zhǔn)溶液，8種有機(jī)氯農(nóng)藥的保留時間見表1。實際樣品中檢出4種有機(jī)氯農(nóng)藥，其中α-BHC為1.87 ng/mL，p,p′-DDE為2.86 ng/mL，p,p′-DDD為2.48 ng/mL，o,p′-DDT為2.60 ng/mL。實驗結(jié)果表明，利用C18和Florisil固相萃取柱分別對樣品進(jìn)行提取和凈化，正己烷-丙酮(9∶1)溶劑對待測物進(jìn)行洗脫后，8種有機(jī)氯農(nóng)藥的精密度和回收率均較為理想。該方法快速、高效，能夠滿足血清中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留檢測的要求。

圖1 有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(A，5 ng/mL)及血清樣品(B)的色譜圖

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Determination of Organochlorine Pesticide Residues in Serum by Solid Phase Extraction and Gas Chromatography

DUAN Li-cun，ZHOU Jian-yu，LI Jia-xin，LI Peng-fei，XU Fang，WANG Qi*

(School of Public Health,Kunming Medical University,Kunming 650500,China)

A method was developed for the determination of eight kinds of organochlorine pesticides，including DDTs and BHCs etc. in serum by solid-phase extraction(SPE) and gas chromatography(GC).The samples were treated by ultrasonic precipitation，cleaned on a Cleanert ODS C18N solid phase extraction column with hexane and acetone(9∶1) and purified on a Florisil solid phase extraction column.Then，the samples were blew with nitrogen until the test tubes were dry，and resolved with N-hexane.The targeted compounds were analyzed by GC with electron capture detector(ECD) .The calibration curves were linear in the range of 2-200 ng/mL，with correlation coefficients(r) of 0.996 4-0.999 0.The limits of detection(LOD) were in the range of 0.1-0.9 ng/mL，and the limits of quantitation(LOQ) were in the range of 0.4-3.0 ng/mL.The results showed that the spiked recoveries were in the range of 80.5%-112.7% with relative standard deviations(RSD)of 2.1%-7.9%.The method has high accuracy and precision，and could be used for the analysis of trace organochlorine pesticides in serum samples.

serum;DDTs;BHCs;organochlorine pesticides;solid-phase extraction(SPE);gas chromatography(GC)

2016-04-12；

2016-06-28

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.016

O657.71;F767.2

A

1004-4957(2016)12-1606-05

*通訊作者：王 琦，博士，副教授，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)，Tel：0871-65922924，E-mail：lwangqi@163.com