氟中毒對(duì)小鼠精子ATP的影響

李素娟，張?chǎng)瑥埿⑶澹瑢O子龍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；3.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，山西朔州036002）

氟中毒對(duì)小鼠精子ATP的影響

李素娟1，張?chǎng)?，張孝清3，孫子龍1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；3.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，山西朔州036002）

為探討氟化鈉對(duì)雄性小鼠精子ATP的影響，將24只雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（供給蒸餾水）、低氟組（供給含25 mg/L NaF的蒸餾水）、中氟組（供給含50 mg/L NaF的蒸餾水）、高氟組（供給含100 mg/L NaF的蒸餾水），180 d后檢測(cè)小鼠精子在有氧呼吸與無(wú)氧酵解中產(chǎn)生的ATP含量。結(jié)果表明，氟化鈉能夠降低小鼠不同呼吸模型下精子ATP含量。氟化鈉能夠降低小鼠精子ATP含量，主要是通過(guò)改變有氧呼吸產(chǎn)生ATP的能力發(fā)揮作用。

氟中毒；精子；ATP

氟可以突破血睪屏障和血-附睪屏障，可以破壞其結(jié)構(gòu)，使代謝功能等受到損傷，導(dǎo)致生精功能和精子生存的內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變[1]，進(jìn)而對(duì)睪丸的生精細(xì)胞、支持細(xì)胞及精子產(chǎn)生毒副作用[2]。研究表明，機(jī)體攝入過(guò)量氟可導(dǎo)致睪丸生精功能降低，使精液質(zhì)量下降，不育率升高[3]。

本試驗(yàn)通過(guò)建立線粒體有氧呼吸與無(wú)氧酵解模型檢測(cè)小鼠精子在不同呼吸途徑中所產(chǎn)生的ATP含量，從而為進(jìn)一步闡明氟的生殖毒性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

24只昆明小鼠，雄性，8周齡（體質(zhì)量為20～ 25 g），購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

氟化鈉（NaF，AR，天津市化學(xué)試劑三廠）；GENMED精子細(xì)胞BWW培養(yǎng)液（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）；CCCP（碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙，美國(guó)SIGMA公司）；丙酮酸鈉（美國(guó)AMRECSO）；D-無(wú)水葡萄糖（美國(guó)AMRESCO）；ATP檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成4組，每組6只，分籠飼養(yǎng)，分為對(duì)照組、低氟組、中氟組、高氟組。對(duì)照組飲用蒸餾水，低、中、高氟組分別供給含25，50，100 mg/LNaF的蒸餾水。飼養(yǎng)環(huán)境干凈整潔，小鼠自由飲水、采食。

1.3.2 小鼠骨骼中氟含量的測(cè)定飼養(yǎng)180 d，各組小鼠斷頸處死，摘取小鼠股骨，在鼓風(fēng)干燥箱中105℃烘烤4 h，烘烤結(jié)束后，將其放在通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上灼燒至無(wú)煙，稍冷移入灰化爐中在560℃下灰化3～4 h，用離子濃度測(cè)量?jī)x檢測(cè)骨灰中氟的濃度。

1.3.3 小鼠精子的采集及前處理180 d后，無(wú)菌剖腹小鼠，立即切取小鼠附睪尾與輸精管（盡量剔除其表面脂肪及網(wǎng)膜），放入盛有1 mLPBS和50 μL BWW（37℃預(yù)熱）的小平皿中，用眼科剪將其剪碎，用1 mL注射器將懸浮液輕輕吹打5次，使精子充分游離出來(lái)，靜置2 min，并將其吸入1.5 mL EP管中，備用。

1.3.4 小鼠精子呼吸模型的建立取部分采集好的精子，加入2 μL（5 mmol/L）丙酮酸鈉溶液建立線粒體有氧呼吸模型，并將其轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的EP管中，待測(cè)ATP含量；同時(shí)，取部分精子，加入葡萄糖（5 mmol/L）和CCCP（1 μmol/L）各2 μL建立無(wú)氧酵解模型，待測(cè)相應(yīng)呼吸模型下ATP含量[4-5]。

1.3.5 小鼠精子在不同呼吸模型下ATP含量的測(cè)定取1.3.4已建立呼吸模型的精子100 μL，嚴(yán)格按照ATP檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，利用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司）檢測(cè)ATP含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件的one-wayanalysis ofvariance（ANOVA）方法進(jìn)行Dunnett檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠骨骼中氟的含量分析

從圖1可以看出，與對(duì)照組相比，染氟組隨著氟化鈉濃度的增加，骨氟的含量逐漸升高，且與對(duì)照組相比，低、中、高氟組骨氟含量差異達(dá)極顯著。

2.2 氟對(duì)小鼠精子ATP含量的影響

2.2.1 小鼠精子總ATP含量小鼠精子在正常呼吸作用下，ATP總含量如圖2所示。由圖2可知，隨著NaF濃度的增加，小鼠精子總ATP含量呈下降趨勢(shì)，且低氟時(shí)總ATP含量顯著下降，中、高氟組呈極顯著下降。

2.2.2 有氧呼吸模型下小鼠精子ATP含量在氟化鈉的作用下，小鼠精子有氧呼吸模型下ATP的含量如圖3所示。由圖3可知，與對(duì)照組相比，隨著NaF濃度的增加，小鼠精子ATP的含量總體呈下降趨勢(shì)，低、中氟組ATP含量顯著下降，高氟組呈極顯著下降。

2.2.3 無(wú)氧酵解模型下小鼠精子ATP含量在氟化鈉的作用下，小鼠精子無(wú)氧酵解ATP含量如圖4所示。由圖4可知，與對(duì)照組相比，隨著NaF濃度的增加，小鼠精子ATP的含量總體呈下降趨勢(shì)，但僅高氟組顯著下降，低、中氟組無(wú)顯著變化。

3 討論

氟中毒的主要臨床癥狀表現(xiàn)為氟斑牙和氟骨癥[6-7]。氟化物的親骨性很強(qiáng)，機(jī)體吸收的氟大部分都蓄積到骨骼中。骨氟含量是反映體內(nèi)氟蓄積狀況的最好指標(biāo)。本試驗(yàn)選用小鼠股骨作為試驗(yàn)對(duì)象，利用離子濃度測(cè)量?jī)x檢測(cè)小鼠骨骼中氟的含量，結(jié)果表明，隨著飲水中氟濃度的升高，小鼠股骨中氟的含量呈極顯著升高。

氟化物可直接損害精子，使完整的精子溢出鉀離子，抑制Na+/K+泵，干擾精子線粒體膜電位[8]，使精子電解質(zhì)失衡，進(jìn)而損害精子的形態(tài)和功能[9]。Chinoy等[10-11]研究表明，氟化物可使小鼠附睪尾中精子活率、活力、密度均下降，出現(xiàn)大量的畸形精子，并且精子的頂體功能也減弱，頂體素和透明質(zhì)酸酶含量下降，精子的形狀與代謝發(fā)生變化，精子線粒體的活性下降。氟中毒還可使小鼠精子的超激活運(yùn)動(dòng)能力[12]、趨化性功能明顯降低[13]，且其損傷程度隨著染氟劑量的增加而加大。氟化物會(huì)誘導(dǎo)精子產(chǎn)生活性氧，而過(guò)多活性氧會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，嚴(yán)重影響精子質(zhì)膜流動(dòng)性，危害精子獲能、精卵識(shí)別和受精過(guò)程，同時(shí)破壞精子DNA完整性，常引起不育或者圍產(chǎn)期流產(chǎn)。但至今仍鮮有報(bào)道系統(tǒng)性闡述亞慢性氟中毒對(duì)精子線粒體有氧呼吸和無(wú)氧酵解的影響。

解偶聯(lián)劑CCCP（碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙）可以抑制精子線粒體有氧呼吸作用產(chǎn)生ATP[14]。Hereng等[15]在人體精子中加入外源的丙酮酸鈉，發(fā)現(xiàn)精子細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯提高，同時(shí)線粒體的氧化磷酸化能力明顯增強(qiáng)。因此，本試驗(yàn)選擇在精子細(xì)胞培養(yǎng)液中加入丙酮酸鈉建立線粒體有氧呼吸模型；在精子細(xì)胞培養(yǎng)液中加入葡萄糖和CCCP誘導(dǎo)無(wú)氧酵解，建立無(wú)氧呼吸模型。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，隨著NaF濃度的增加，小鼠精子總ATP含量總體呈下降趨勢(shì)，且主要通過(guò)影響有氧呼吸發(fā)揮作用。這些結(jié)果可能與氟離子能夠抑制酶的活性中心相關(guān)。Chinoy等[16]研究證明，染氟可導(dǎo)致家兔精子的三磷酸腺苷酶（ATPase）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和酸性磷酸酶（ACP）的活性下降，而ATPase，SDH，ACP均是能量代謝的重要酶系。其具體機(jī)制還有待于今后進(jìn)一步研究。

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Effect of Fluoride on Sperm ATP in Mice

LI Su-juan1，ZHANGWen2，ZHANGXiao-qing3，SUNZi-long1
（1.College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.College ofFood Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；3.Department ofBiological Engineering，Shuozhou Vocational Technical College，Shuozhou 036002，China）

To study the effect of sodium fluoride on the ATP of sperm in male mice,24 male mice were randomly divided into control group,lowfluoride group,medium fluoride group,and high fluoride group.The four groups were orally administrated with 0,25, 50,100 mg/L NaF for 180 d.Glycolysis and mitochondrial respiration models were established for the detection of ATP content.The results showed that the sodium fluoride could reduce different breathing sperm ATP content in mice,through the change in the ATP produced bymitochondrial respiration.

fluoride;sperm;ATP

S859.8

A

1002-2481（2016）04-0480-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.14

2015-12-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201965）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（201203）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)青年拔尖創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（TYIT201408）

李素娟（1991-），女，山西運(yùn)城人，在讀碩士，研究方向：環(huán)境獸醫(yī)學(xué)及營(yíng)養(yǎng)代謝病。孫子龍為通信作者。