八味中草藥對維氏氣單胞菌TH0426生物膜形成的影響

張冬星 ， 康元環(huán) ， 李溫明 ， 張海月 ， 畢建飛 ， 單曉楓 ， 錢愛東 ， 田佳鑫

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林長春130118 ； 2.鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 遼寧鐵嶺112000)

八味中草藥對維氏氣單胞菌TH0426生物膜形成的影響

張冬星1， 康元環(huán)1， 李溫明2， 張海月1， 畢建飛1， 單曉楓1， 錢愛東1， 田佳鑫1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林長春130118 ； 2.鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 遼寧鐵嶺112000)

為了解中藥對維氏氣單胞菌 (Aerornomasveronii, AV)TH0426株生物膜形成的影響。采用微孔板半定量法，研究五倍子、紅花、黃連、鹿銜草、地榆、射干、姜厚樸及黃芩8味中藥水煎液對AV TH0426株生物膜的影響。結(jié)果顯示，低濃度五倍子、紅花和黃連水煎液對菌株生長及生物膜形成均無明顯影響；而高濃度五倍子和黃連水煎液可通過抑制菌株的生長來影響生物膜的形成，高濃度紅花水煎液對生物膜抑制作用明顯，且不影響菌株的正常生長；其余五味中藥鹿銜草、地榆、射干、姜厚樸和黃芩對菌株的生長及生物膜形成無明顯影響。表明高濃度五倍子、紅花及黃連水煎液能抑制AV TH0426株生物膜的形成，具有抗AV TH0426株生物膜的作用，這將為從抗生物膜角度防治維氏氣單胞菌提供有益參考。

五倍子 ； 紅花 ； 維氏氣單胞菌 ； 生物膜

維氏氣單胞菌(Aerornonasveronii，AV)又稱凡隆氣單胞菌、維羅納氣單胞菌[1]，該菌隸屬于氣單胞菌科，氣單胞菌屬，且廣泛存在于自然界水域、土壤和水生動(dòng)物體內(nèi),可引起鯽、鯉、鰻及鱘魚等多種魚類發(fā)病[2-4]，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。生物膜(biofilm, BF)被視為一種生物屏障，是由細(xì)菌通過胞外多糖復(fù)合物或纖毛共同作用粘附在生物材料或人體組織表面,不斷分裂繁殖,并分泌大量胞外多糖復(fù)合物而共同形成的，由于BF內(nèi)細(xì)菌代謝緩慢，使其對抗生素敏感性較低甚至阻滯抗生素分子進(jìn)入BF[5]，這使得BF清除十分困難，常致頑固性感染。我國傳統(tǒng)中藥具有抗病菌、抗病毒及提高免疫力等作用,克服了化學(xué)藥物和抗生素類藥物的缺陷, 同時(shí), 中草藥還具有無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性、能增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力等優(yōu)點(diǎn)[6]。因此，本研究利用微孔板半定量法，檢測五倍子及紅花等八味中藥水煎液對維氏氣單胞菌生物膜形成的影響，探討不同中藥對生物膜形成的影響，為從抗生物膜形成角度防治維氏氣單胞菌提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及中草藥的選取 黃顙魚源維氏氣單胞菌(AV)TH0426菌株由浙江省淡水水產(chǎn)研究所徐洋助理研究員惠贈(zèng)。通過本實(shí)驗(yàn)室前期對單味中藥的初篩，本試驗(yàn)選取了抑菌效果明顯的五倍子、紅花、黃連、鹿銜草、地榆、射干、姜厚樸和黃芩中草藥，均購自長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.2 儀器設(shè)備與試劑耗材 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀，恒溫培養(yǎng)箱，粉碎機(jī)，電磁爐，烘箱，超凈工作臺，無水乙醇，高壓蒸汽鍋，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，0.5%結(jié)晶紫溶液，0.85%生理鹽水，RS瓊脂培養(yǎng)基等。

1.3 植物水煎液的制備 根據(jù)任曉鏷等[7]中藥處理方法，將中草藥進(jìn)行打碎處理，使其成為直徑約1 mm大小的顆粒，進(jìn)行水煎處理，稱取100 g粉末至瓷量杯中，并加入一定量的雙蒸水(水浸過藥面2-3 cm)，浸泡30 min，大火煮開，文火熬20 min，紗布過濾藥液，濾渣再進(jìn)行同樣處理，合并2次藥液，115℃高壓滅菌15 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌液制備 取100 μL AV TH0426 (-70℃冷凍菌液)于5 mL TSB中，在30 ℃的搖箱中搖16 h后，在RS瓊脂培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落，接種到5 mL TSB中置于30 ℃振搖24 h；取培養(yǎng)后的菌液0.5 mL，均勻涂抹普通瓊脂平板上，30 ℃ 培養(yǎng)24 h；取滅菌生理鹽水與培養(yǎng)板內(nèi)，用滅菌的棉簽輕輕洗下平板上的菌苔，加入滅菌生理鹽水至10 mL，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，?xì)菌數(shù)稀釋約1×105CFU/mL。

1.5 抑菌試驗(yàn) 取活化的菌液在固體培養(yǎng)基上涂抹100 μL，用打孔器在平板上打4個(gè)孔，將其在酒精燈上微微加熱后置于4 ℃冰箱中30 min，并在打好的孔內(nèi)加入50 μL藥液，再置于30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈的大小。抑菌效果按照《中藥藥理學(xué)》中的標(biāo)準(zhǔn)判定，即：抑菌直徑大于20 mm為極度敏感；15～19 mm為高度敏感；10～14 mm為中度敏感；7～10 mm為低度敏感；7 mm以下為無作用。

1.6 八味中藥MIC的測定 準(zhǔn)備活化好的菌液，并采用兩倍稀釋方法測定藥物對供試菌MIC[8]。即取無菌試管10支，在每支試管內(nèi)加入1 mL的TSB培養(yǎng)液。吸取1 mL的藥液(1 g /mL)入第1支試管，混勻，再吸取1 mL 到第2支試管，逐一進(jìn)行到第9支管，棄去所吸取的1 mL 混合液，第10支為藥物空白對照。之后在每支試管內(nèi)依次加入1 mL稀釋至1×105CFU/mL菌液，30 ℃培養(yǎng)24 h；取出試管進(jìn)行觀察，找出出現(xiàn)菌液清亮的最低藥物濃度，即為該藥物的最小抑菌濃度 (MIC) 值。

1.7 生物膜試驗(yàn) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，采用改良的微量板半定量法進(jìn)行檢測。按照1∶100比例接種對數(shù)期生長的菌液至TSB液體培養(yǎng)基中(此時(shí)加入不同濃度的中草藥水煎液，將培養(yǎng)液與水煎液混合均勻再上樣至96孔板中)，混勻， 再吸取200 μL混合液于96孔板中，每個(gè)濃度中草藥液處理8孔，同時(shí)設(shè)空白對照組，陽性對照組，陰性對照組及不加菌液的中草藥藥液對照組。30 ℃培養(yǎng)24 h，取出后測定菌株生長濁度D630值，吸出菌液，無菌生理鹽水洗滌4次，56 ℃烘干固定1 h，0.5%結(jié)晶紫溶液染色 5 min，流水沖去染液，室溫晾干后測定D490值。將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。每個(gè)試驗(yàn)在不同的時(shí)間進(jìn)行，重復(fù)3次。

1.8 不同濃度中藥水煎液對菌株生物膜形成的影響 將8味中藥濃度梯度設(shè)置為：0%、1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%與40%，按1.7方法分別測定生物膜形成。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)結(jié)果采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件檢驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)藥物濃度均設(shè)8個(gè)復(fù)孔，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 八味中藥對AV TH0426抑菌圈直徑測定 五倍子、紅花、黃連、鹿銜草、地榆、射干、姜厚樸、黃芩8味中藥對AV TH0426的抑菌圈直徑分別為12.33、13.67、13.33、14.33、13.33、10.67、 13.00、8.67 mm。五倍子、紅花、黃連、鹿銜草、地榆、射干、姜厚樸對試驗(yàn)菌株有較強(qiáng)抑制作用。

2.2 8味中藥對AV TH0426 MIC的測定 五倍子、紅花、黃連、鹿銜草、地榆、射干、姜厚樸、黃芩8味中藥對AV TH0426的MIC分別為31.25、15.63和31.25、62.50、7.81、31.25、15.63、125.00 mg/mL。紅花、姜厚樸、地榆對試驗(yàn)菌株的抑菌作用較強(qiáng)。

圖1 不同濃度地榆(A)、射干(B)、姜厚樸(C)、黃芩(D)水煎液對AV TH0426生長及其生物膜形成影響*表示與0%水煎液組比較P<0.05，下圖同

圖2 不同濃度五倍子(A)、紅花(B)、黃連(C)及鹿銜草(D)水煎液對維氏氣單胞菌TH0426生長及其生物膜形成影響

2.3 8味中藥水煎液對AV TH0426生長及其生物膜形成的影響 不同濃度中藥水煎液對AV TH0426的生長及生物膜形成的試驗(yàn)結(jié)果顯示，五倍子與黃連在抑制細(xì)菌生長的同時(shí)，也抑制細(xì)菌生物膜的形成；紅花對細(xì)菌生長無影響，但能有效抑制細(xì)菌生物膜形成；鹿銜草、地榆、射干、姜厚樸、黃芩對細(xì)菌生長及生物膜的形成影響不大。由圖1、圖2可知,隨著藥物濃度的升高，地榆、射干、姜厚樸、黃芩及鹿銜草水煎液對AV TH0426生長的抑制作用較弱，菌株生物膜形成能力降低緩慢，不能完全抑制菌株生物膜的形成。添加不同濃度的五倍子水煎液(圖2-A)對AV TH0426生物膜形成能力有抑制作用，當(dāng)五倍子水煎液濃度高于10%時(shí)，細(xì)菌生物膜形成能力呈下降趨勢，當(dāng)濃度達(dá)到40%時(shí)，細(xì)菌生物膜形成能力幾乎為零。與之相一致的是，隨著五倍子水煎液濃度的增加，細(xì)菌的生長呈下降趨勢。隨著紅花水煎液(圖2-B)濃度的增大，AV TH0426生物膜形成能力逐漸減弱，當(dāng)紅花水煎液濃度高于2.5%時(shí)，生物膜形成能力下降較為明顯，與五倍子相反的是，各濃度(0%～40%)紅花水煎液對細(xì)菌的生長無明顯影響。隨著黃連水煎液(圖2-C)濃度增加，AV TH0426的生長呈下降趨勢，且細(xì)菌生物膜形成能力也逐漸減弱。當(dāng)黃連水煎液濃度低于5%時(shí)，對細(xì)菌的生長及生物膜形成能力均無影響；當(dāng)黃連水煎液濃度高于5%時(shí)，細(xì)菌的生長有所下降，同時(shí)生物膜形成能力也有下降趨勢，黃連水煎液濃度達(dá)到40%時(shí)，生物膜形成能力基本消失。與五倍子相比，黃連水煎液有效抑制生物膜形成的濃度比五倍子濃度低；但黃連水煎液與紅花水煎液抑制作用結(jié)果有所不同，即高濃度黃連水煎液通過對細(xì)菌生長的抑制作用，使細(xì)菌生物膜形成能力減弱，而紅花對細(xì)菌生長無明顯抑制作用。

3 討論

細(xì)菌生物膜(Biofilm, BF) 是指細(xì)菌附著于有生命或無生命材料表面，由細(xì)菌及其分泌的胞外多聚物共同組成的呈膜狀的細(xì)菌群體，是細(xì)菌相對于浮游狀態(tài)的一種群體生活方式。近年來，有關(guān)BF感染的報(bào)道(病例)明顯增多[9]，細(xì)菌一旦形成生物膜，其對抗生素和消毒劑的抵抗力比浮游菌要顯著增強(qiáng)，其引發(fā)的臨床細(xì)菌感染率達(dá)65%[10]。本試驗(yàn)主要利用五倍子及紅花等8味中藥，探究其對AV TH0426生物膜形成能力的影響。

五倍子的主要成分是五倍子蹂質(zhì)，能夠凝固微生物體內(nèi)的原生質(zhì)及多種酶，對多種細(xì)菌、真菌、酵母都有明顯的抑制作用[11]，該成分可能抑制細(xì)菌的生長，從而達(dá)到抑制生物膜的形成。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著五倍子水煎液濃度升高，菌株的生長及生物膜形成呈下降趨勢，當(dāng)濃度升高到40%時(shí)細(xì)菌的生長受到明顯抑制，同時(shí)生物膜形成能力大大降低。因此五倍子水煎液具有抑制細(xì)菌生物膜形成的作用，且該作用可能是通過抑制菌株正常而實(shí)現(xiàn)的。細(xì)菌生長與生物膜生長的抑制作用不一定表現(xiàn)出平行關(guān)系。與五倍子相比，紅花水煎液對AV TH0426生長幾乎沒有影響，但卻對其生物膜形成能力有較強(qiáng)抑制作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，紅花能夠抑制變形鏈球菌附著能力，使菌斑形成量減少，細(xì)菌總蛋白亦下降，且菌斑中胞外葡聚糖含量降低[12]，這可能使得細(xì)菌分泌物無法聚集從而降低其附著能力。黃連的主要成分是黃連素，對于幽門螺旋桿菌的殺菌機(jī)制可能是抑制菌株呼吸及生長，抑制葡萄糖及糖代謝中間產(chǎn)物的氧化過程，從而殺滅細(xì)菌，被認(rèn)為是抗微生物作用的有效活性物質(zhì)[13]。當(dāng)黃連濃度高于5%時(shí)，細(xì)菌的生長及生物膜形成受到明顯抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)40%時(shí)，生物膜形成能力基本消失。因此，黃連水煎液可能通過抑制AV TH0426的正常生長從而削弱菌株生物膜的形成能力。因此，黃連水煎液抑菌機(jī)制可能與黃連素相關(guān)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜合本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，使用中草藥防治維氏氣單胞菌是可行的，但本研究僅探討了中草藥的體外抑制BF效果，因此，文中所選中草藥在動(dòng)物體內(nèi)是否達(dá)到相同的抑制效果，有待進(jìn)一步通過動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)加以驗(yàn)證、比較研究。

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Effects of Eight Chinese Herbs on Biofilm Formation of Aerornomas veronii

ZHANG Dong-xing1, KANG Yuan-huan1, LI Wen-ming2, ZHANG Hai-yue1,BI Jian-fei1, SHAN Xiao-feng1, QIAN Ai-dong1, TIAN Jia-xin1

(1.College of Animal Science and Technology , Jilin Agricultural University , Jilin 130118，China ; 2. Tieling Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau , Tieling 112000 ， China)

To investigate the role of Chinese herbs on biofilm formation of Aeromonas veronii TH0426, the effects of 8 kinds of Chinese herbs (Galla chinensis, Carthamus tinctorius L., Coptis Chinensis, Pyrda, Burnet ,Blackberry Lily, Jiang Magrolia and Scutellaria) on biolfilm formation of AV TH0426 were studied by using microplate quantification assay.The results showed that there were no obvious effects on growth and biofilm formation of AV TH0426 with low concentration of Galla chinensis,Carthamus tinctorius L., and Coptis Chinensis. The growth and biofilm formation of AV TH0426 was inhibited by high concentration of Galla chinensis and Coptis Chinensis.And the biofilm formation of AV TH0426 was inhibited significantly by high concentration of Carthamus tinctorius L.. But there was little effect on growth of AV TH0426 with high concentration of Carthamus tinctorius L..While the other 5 Chinese herbs had no obvious effects on growth and biofilm formation of AV TH0426.The inhibitory effect on biofilm of AV TH0426 was significant under the conditions of high concentration of Galla chinensis, Coptis Chinensis and Carthamus tinctorius L.The result will lay a theoretical foundation for preventing Aerornonas veronii on the aspect of anti-biofilm.

Galla chinensis; Carthamus tinctorius L.; Biofilm

s:SHAN Xiao-feng;Qian Ai-dong

2015-11-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201927)；吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204065NY)

張冬星(1992-)，男，碩士生，從事動(dòng)物分子細(xì)菌學(xué)研究，E-mail: xx498292459@163.com

單曉楓，E-mail: sxf1997@163.com；錢愛東，E-mail: qianaidong0115@163.com

S853.72

A

0529-6005(2016)11-0066-04