鵝巴氏桿菌與大腸桿菌混合感染的診治

張 雙 ， 柏亞鐸 ， 李 歐 ， 胡桂學

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院 ， 吉林長春130118 ；2.北京出入境檢驗檢疫局 ， 北京朝陽100193；3.吉林省白城動物疫病預防控制中心 ， 吉林白城137000)

鵝巴氏桿菌與大腸桿菌混合感染的診治

張 雙1， 柏亞鐸2， 李 歐3， 胡桂學1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院 ， 吉林長春130118 ；2.北京出入境檢驗檢疫局 ， 北京朝陽100193；3.吉林省白城動物疫病預防控制中心 ， 吉林白城137000)

禽巴氏桿菌病又稱禽霍亂，是一種由巴氏桿菌引起的急性、接觸性、敗血性傳染病，主要感染雞、鴨、鵝等禽類。該病的臨床特征表現(xiàn)為病禽食欲不振、體溫升高、呼吸困難、腹瀉等；剖檢特征為心外膜散在針尖樣點狀出血、心包積液、心冠脂肪出血尤為嚴重，肝臟有白色細小壞死點，腸黏膜和腹部脂肪呈廣泛的點狀出血。大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的以敗血癥、心包炎、肝周炎以及禽氣囊炎為主要特征的多種疾病的總稱，常與其他病原菌混合感染或并發(fā)感染引起動物發(fā)病并導致患畜死亡[1-2]。2015年9月10日吉林地區(qū)某霍爾巴基鵝場鵝群出現(xiàn)大批量死亡現(xiàn)象，本實驗室通過對該鵝場送檢的6份病料進行臨床剖檢、細菌分離鑒定與藥敏試驗，對病鵝的病因作出了診斷并提出了針對性的治療方案，為這類疾病的快速治療和藥物的合理使用提供了臨床參考。

1 發(fā)病情況

2015年9月8日，吉林地區(qū)某鵝場突然有約5萬羽(近1/10)霍爾多巴基鵝出現(xiàn)食欲下降、飲水減少、精神委靡、腹瀉等癥狀。9月8日約有500羽鵝死亡，9月9日約1 200羽鵝相繼死亡，9月10日鵝群出現(xiàn)大批量死亡，發(fā)病與死亡情況未見減輕。調(diào)查證明，該鵝場每年按正常免疫程序對鵝群進行小鵝瘟與新城疫二聯(lián)苗免疫。

2 臨床癥狀與剖檢變化

患病鵝羽毛粗亂、精神沉郁、食欲下降、呼吸困難、雞冠和肉髯發(fā)紺、口鼻流出黏液并伴有咳嗽、噴嚏，出現(xiàn)腹瀉癥狀，排出綠色或白色的帶有腥臭味米湯樣稀糞。對患病鵝進行剖檢，主要病理變化表現(xiàn)為纖維素性心包炎、心包積液、心冠脂肪處出現(xiàn)許多針尖狀出血點，心臟和肝包膜呈白色渾濁，有明顯的纖維素性附著物(見中插彩插圖1A)；氣囊渾濁、肥厚、有干酪樣滲出物，肝臟有明顯的白色針尖狀壞死點(見中插彩插圖1B)。

2.1 細菌的分離培養(yǎng) 無菌采集鵝的心臟、肝臟于含胎牛血清的TSA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，得到兩種形態(tài)不同的菌落，革蘭染色鏡檢均為陰性桿菌。其中一類菌染色鏡檢為兩極濃染的短桿菌或球桿菌，初步懷疑為巴氏桿菌；另一類菌鏡檢為染色均一的短桿菌，初步懷疑為大腸桿菌。分別挑取兩種形態(tài)不同的菌落接種于TSB培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)，并標記為A、B菌液。

2.2 動物回歸試驗將20只昆明系小鼠(體重18 g～25 g, 購自長春實驗動物中心)隨機分為4組，Ⅰ組：腹腔注射0.2 mL菌液A；Ⅱ組：腹腔注射0.2 mL菌液B；Ⅲ組：腹腔注射0.1 mL 菌液A與0.1 mL 菌液B；Ⅳ組：腹腔注射0.2 mL TSB培養(yǎng)基。隔日觀察，Ⅰ組小鼠全部死亡，Ⅱ組小鼠死亡3只，Ⅲ組全部死亡，Ⅳ組無死亡。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 培養(yǎng)特性觀察 無菌采集Ⅰ組小鼠肝臟于TSA培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，結果TSA培養(yǎng)基長出形態(tài)單一、灰白色、露珠狀針尖大小的菌落，伊紅美藍培養(yǎng)基無菌落。采用相同方法對Ⅱ組小鼠肝臟進行劃線培養(yǎng)，結果在伊紅美藍培養(yǎng)基上長出形態(tài)單一、黑色帶有金屬光澤的圓形菌落。

2.3.2 生化試驗鑒定 分別將菌液A與B接種一組發(fā)酵管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后觀察結果。結果見表1，A菌液可以分解葡萄糖、木糖、蔗糖、甘露糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖和麥芽糖，吲哚試驗、硝酸鹽利用試驗呈陽性，M、R，試驗、V-P試驗、硫化氫試驗等為陰性；B菌液可以分解葡萄糖、乳糖等多種糖類產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，M、R，試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗為陽性, V-P試驗、硫化氫、枸櫞酸鹽、尿素酶利用試驗為陰性。生化試驗結果顯示，A菌液符合巴氏桿菌的生化特性，B菌液符合大腸桿菌的生化特性。

表1 分離菌的生化特性

+:陽性；—:陰性

圖2 巴氏桿菌PCR鑒定

M：Marker DL-2 000； 1：檢測樣品； 2：陽性對照

2.3.3 PCR鑒定 分別以菌液A和菌液B為模板進行PCR鑒定，反應體系為無菌水17 μL，模板2 μL，dNTP2 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，ExTaq0.5 μL，上下游引物各0.5 μL。A菌液PCR引物根據(jù)巴氏桿菌Kmt1序列(AF16259)設計，為F：5'-GGTCTTAGATGAGCGACAAGG-3'；R：5'-GCGCTATTACTTCCTTCGTTC-3'；B菌液采用16S rRNA通用引物。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，A菌液在460 bp處出現(xiàn)條帶，長度與結果相符(圖2)，經(jīng)測序與Blast在線比對確定為巴氏桿菌。B菌液結果顯示在1 700 bp處出現(xiàn)條帶(圖3)，經(jīng)測序與Blast在線比對，結果與動物大腸桿菌E482同源性為98%。

圖3 大腸桿菌16S rRNA鑒定

M：Marker DL-2 000； 1、2：檢測樣品

結合患病鵝臨床剖檢癥狀、通過細菌的分離、生化試驗、PCR鑒定等，可推斷A菌為巴氏桿菌，B菌為大腸桿菌。

3 敏感藥物的篩選與治療

3.1 藥物敏感試驗 按照世界衛(wèi)生組織推薦的Kirby-Bauer氏法[3]，將純化的巴氏桿菌和大腸桿菌菌液計數(shù)后分別涂抹于TSA培養(yǎng)基上，選取常見的15種藥物進行藥物敏感試驗，結果見表2。表2結果顯示15種常見抗生素中，2種菌敏感性較高的主要包括頭孢曲松、磷霉素、慶大霉素與氯霉素。

3.2 治療 根據(jù)藥物敏感試驗結果以及藥物殺菌作用機制和經(jīng)濟價值等因素，最終選用磷霉素可溶性粉末為臨床治療藥物。將磷霉素可溶性藥粉溶于鵝群日常飲用水中，每升水30 mg～60 mg,早晚各1次,持續(xù)用藥觀察發(fā)病情況。結果給藥3 d后鵝群死亡率明顯降低，5 d后幾乎無發(fā)病情況。

4 分析與討論

巴氏桿菌病是由巴氏桿菌引起的一種畜禽共患傳染病，巴氏桿菌通過呼吸道、消化道、損傷皮膚以及血吸昆蟲等傳播感染，主要侵害家禽和野生動物，并且具有較高的發(fā)病率和死亡率，其中幼齡動物最易感染，死亡率也較高[4]。大腸桿菌病是由大腸埃希菌中的某些致病性血清型菌株引起的疾病的總稱，主要通過消化道感染，一般表現(xiàn)為繼發(fā)感染，一年四季均可發(fā)生。巴氏桿菌與大腸桿菌混合感染在畜禽養(yǎng)殖中較為普遍，在梅花鹿、牛，鴨等養(yǎng)殖中已有相關報道，并對我國的畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失。目前，對于巴氏桿菌和大腸桿菌的診斷方法主要包括ELISA抗體捕獲法、特異性PCR診斷方法、ERIC-PCR檢測方法、多重PCR方法以及常規(guī)實驗室診斷與血清學診斷方法[5]。

表2 巴氏桿菌對15種常用藥物的敏感性試驗結果 (抑菌環(huán)直徑單位：mm)

本試驗通過對患病鵝進行臨床癥狀觀察，并對病料進行了細菌的分離培養(yǎng)以及培養(yǎng)特性觀察、生化試驗、分子生物學診斷，確診為巴氏桿菌與大腸桿菌混合感染。造成混合感染的主要原因是由于鵝場飼養(yǎng)管理不當，禽舍消毒不徹底，環(huán)境潮濕等，造成了大量的病原菌滋生。當鵝群機體抵抗力較弱時，強毒菌趁機侵入并迅速進入血液，造成敗血癥導致發(fā)病，并伴隨大腸桿菌的繼發(fā)感染，導致鵝群的大量死亡。通過藥物敏感試驗篩選出對分離到的巴氏桿菌與大腸桿菌均高度敏感的抗生素，主要包括頭孢曲松、磷霉素、慶大霉素與氯霉素。結合兩種細菌的藥物敏感性，依據(jù)藥物的殺菌機制和經(jīng)濟價值等因素，采用敏感的磷霉素作為臨床用藥，收到了良好的治療效果。

試驗中采用的臨床剖檢結合傳統(tǒng)細菌分離培養(yǎng)、生化試驗、分子生物學診斷的組合診斷方法為該鵝場患病鵝的治療節(jié)省了寶貴時間，使藥物對該病的治療提供了更有利的條件，同時為基層獸醫(yī)臨床細菌學診斷提供了技術支持。采用的藥物敏感試驗，篩選敏感藥物并結合藥物殺菌機制和經(jīng)濟價值的藥物選擇方法為臨床合理用藥提供了參考意見。

[1] 刁有祥, 李久芹, 陳慶普. 山東省雞大腸桿菌的分離鑒定[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2002, 24(1): 52-56.

[2] 申圣林, 夏禮杰, 徐增強. 肉鴨霍亂并發(fā)大腸桿菌病的診斷[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2015, 11: 293-294.

[3] 范歡, 陳帆, 溫學峰, 等. 丹頂鶴大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2009, 45(6): 81-82.

[4] 陳慶勛. 牛巴氏桿菌病與附紅細胞體病混合感染的綜合防治[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2012, 31(6): 45-46．

[5] Hricinova M, Holoda E,Mudronova D,etal. MULTIPLEX PCR assay for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Haemophilus parasuis in lungs of pigs from a slaughterhouse [J]. Folia Microbiol, 2010, 55: 635-640.

2015-12-02

吉林省重大科技攻關項目(09ZDGG008)

張雙(1988-)，男，碩士，主要從事動物病毒學研究，E-mail:benxiaohaigogo@126.com

胡桂學，E-mail: huguixue901103@163.com

S858.31

B

0529-6005(2016)11-0057-03