葛根素對(duì)熱應(yīng)激致牛睪丸支持細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

叢 霞 ， 張東君 ， 任婷婷 ， 張 倩 ， 朱麗萍 ， 李 琪 ， 曹榮峰 ， 田文儒 ， 李華濤

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 山東青島266109 ； 2.肥城市畜牧獸醫(yī)局山東肥城271600)

葛根素對(duì)熱應(yīng)激致牛睪丸支持細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

叢 霞1， 張東君2， 任婷婷1， 張 倩1， 朱麗萍1， 李 琪1， 曹榮峰1， 田文儒1， 李華濤1

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 山東青島266109 ； 2.肥城市畜牧獸醫(yī)局山東肥城271600)

葛根素(Pue)是從中藥野葛或甘葛藤根中提取的黃酮類化合物， 有明顯的抗氧化功能。 Pue是否有對(duì)熱應(yīng)激時(shí)牛睪丸支持細(xì)胞 (SCs)保護(hù)作用尚不清楚。 本研究采用42 ℃熱應(yīng)激1 h， 然后34 ℃恢復(fù)6 h。 用CCK-8檢測細(xì)胞存活率； 用Hoechst33258檢測細(xì)胞凋亡； 用分光光度法檢測細(xì)胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)的變化， 以及Western-Blot檢測HSP70蛋白表達(dá)。 結(jié)果顯示， 熱應(yīng)激后細(xì)胞存活率下降， 細(xì)胞發(fā)生凋亡， 產(chǎn)生氧化損傷。 葛根素和維生素E可以極顯著降低熱應(yīng)激時(shí)細(xì)胞MDA含量， 顯著增加SOD、 CAT和GSH-Px活力。 Pue與維生素E組相比無顯著性差異。 此外， 葛根素可顯著增加受熱應(yīng)激SCs中HSP70蛋白的表達(dá)。 上述結(jié)果表明， 葛根素能減少熱應(yīng)激下SCs的氧化損傷， 其機(jī)制可能與提高抗氧化酶活性及增加熱休克蛋白HSP70的表達(dá)有關(guān)。

牛睪丸支持細(xì)胞； 葛根素； 熱應(yīng)激； HSP70 ；氧化損傷

夏季環(huán)境溫度過高，能直接或間接影響雄性家畜的精子活力，能使種公畜精液品質(zhì)下降，從而降低繁殖力。睪丸支持細(xì)胞(Sertoli Cells，SCs)又稱為精子的保育細(xì)胞，參與構(gòu)成血睪屏障，在生殖過程中起著重要作用，支持細(xì)胞數(shù)量多少和質(zhì)量高低直接決定著雄性的生殖功能[1]。睪丸對(duì)高溫較敏感，熱應(yīng)激能誘發(fā)豬睪丸細(xì)胞氧化損傷[2]，使小鼠睪丸質(zhì)量下降，生精細(xì)胞凋亡[3]，據(jù)報(bào)道，葛根素對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)作用顯著，并有較強(qiáng)的抗氧化作用，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)效果明顯[4]，但是葛根素能否緩解熱應(yīng)激所致的SCs的氧化損傷作用，目前還未見報(bào)道。本研究觀察葛根素對(duì)熱應(yīng)激誘導(dǎo)的SCs氧化損傷的影響，揭示葛根素對(duì)SCs細(xì)胞受熱應(yīng)激的影響及其可能的作用機(jī)制，為預(yù)防動(dòng)物夏季熱應(yīng)激尋找方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 葛根素(江西本草天工)；維生素E(Sigma)；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒、MDA、SOD、GSH-Px、CAT檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)； Hoechst33258染色液(碧云天生物技術(shù)研究所)；HSP70、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和兔抗羊、羊抗兔IgG-HRP分別購自Santa Cruze公司和Jackson ImmunoResearch公司；Easy See Western Blot Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 SCs的培養(yǎng)、熱應(yīng)激處理及分組 復(fù)蘇已鑒定凍存的原代SCs[5]，用含13%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基在34 ℃含5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，在細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%～90%時(shí)傳代，傳到三代時(shí)用于試驗(yàn)。將細(xì)胞分為34 ℃對(duì)照(Ⅰ)組；34 ℃+Pue(Ⅱ)組；42 ℃熱應(yīng)激(Ⅲ)組；添加葛根素(IV)組。IV組細(xì)胞分別在添加葛根素和維生素E培養(yǎng)24 h后，42 ℃熱應(yīng)激1 h，然后34 ℃恢復(fù)6 h。

1.3 葛根素和維生素E最佳濃度的篩選 SCs細(xì)胞1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為空白組、藥物組(葛根素5，10，15，20，30，35 μmol/L和40 μmol/L；維生素E 20，25，40，60，80 μmol/L和100 μmol/L)及本底組。在34 ℃下培養(yǎng)24 h，用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，嚴(yán)格按照說明書操作酶標(biāo)儀450 nm測吸光值。細(xì)胞存活率(T/C﹪)=(藥物組OD-本底對(duì)照組OD)/(空白對(duì)照組OD-本底對(duì)照組OD)×100%。

1.4 葛根素對(duì)熱應(yīng)激后SCs存活率的影響 含葛根素(0，15，20，40，60，80，100 μmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，用42 ℃熱應(yīng)激1 h，然后恢復(fù)培養(yǎng)6 h，最后用CCK-8檢測細(xì)胞存活率(方法同1.3)。

1.5 Hoechst33258熒光染色檢測SCs核凋亡 制作細(xì)胞爬片后，將細(xì)胞熱應(yīng)激處理，用4%多聚甲醛室溫固定，再用Hoechst33258染液在37 ℃避光條件下染色10 min，沖洗后加抗熒光淬滅劑，蓋片后用熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核。1.6 MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性的檢測 用0.25%胰酶消化各處理組細(xì)胞并取細(xì)胞沉淀，超聲破碎后，按照相應(yīng)試劑盒說明檢測MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性。

1.7 SCs中HSP70蛋白表達(dá)的檢測 用Western-Blot檢測HSP70蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟參照國曉瞳等進(jìn)行操作[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激誘導(dǎo)SCs凋亡 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，42 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞核由于濃集而呈亮藍(lán)色，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，有破碎(圖1，A)；而正常組細(xì)胞核呈圓形、淡藍(lán)色，形態(tài)正常，內(nèi)有較深藍(lán)色顆粒(圖1，B)。在相同熒光強(qiáng)度下，42 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于正常組。

圖1 Hoechst33258熒光染色顯示熱應(yīng)激組(A)和對(duì)照組(B)

2.2 葛根素和維生素E濃度對(duì)SCs活力的影響 葛根素濃度在0～15 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率均比空白組增加，而隨著葛根素濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸下降(圖2，A)。維生素E濃度在0～25 μmol/L間與空白組相比，細(xì)胞存活率上升，但隨著濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸下降(圖2，B)。因此本試驗(yàn)分別選擇15 μmol/L(Pue)和25 μmol/L(維生素E)作為后續(xù)細(xì)胞處理濃度。

圖2 不同濃度的葛根素(A)及維生素E(B)處理對(duì)SCs存活率的影響

2.3 葛根素對(duì)SCs存活率的影響 受熱應(yīng)激后，SCs存活率(80.67%)極顯著(P<0.01)下降(圖3)，當(dāng)葛根素濃度為15 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率增加，細(xì)胞存活率為90.97%。隨葛根素濃度增加(20-100 μmol/L)，細(xì)胞存活率逐漸降低。

圖3 不同濃度葛根素預(yù)處理對(duì)熱應(yīng)激SCs存活率的影響

2.4 葛根素對(duì)SCs內(nèi)MDA含量及SOD、GSH-PX和CAT活力的影響 結(jié)果如表1所示，與34 ℃對(duì)照組相比，42 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞(P<0.01)和42 ℃+Pue組細(xì)胞(P<0.05)內(nèi)MDA含量均顯著升高；與 42 ℃ 熱應(yīng)激組相比，42 ℃+Pue組和42 ℃+維生素E組細(xì)胞MDA含量均極顯著(P<0.01)降低；42 ℃+Pue和+維生素E組之間無顯著差異(P>0.05)。與34 ℃對(duì)照組相比，42 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞SOD、GSH-Px和CAT活力均極顯著降低(P<0.01)；與42 ℃對(duì)照組相比，42 ℃+Pue組和42 ℃+維生素E組細(xì)胞內(nèi)上述指標(biāo)則顯著升高(P<0.05)；42 ℃+Pue組和42 ℃+維生素E組細(xì)胞間則無顯著差異(P>0.05)。

表1 葛根素對(duì)牛睪丸支持細(xì)胞MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性的影響

注：同列數(shù)據(jù)相比，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，大寫字母相同，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大小寫字母都相同表示差異不顯著(P>0.05)

2.5 葛根素對(duì)SCs中HSP70蛋白表達(dá)的影響 與34 ℃對(duì)照組相比，42 ℃組以及42 ℃+Pue組HSP70蛋白表達(dá)極顯著增加(P<0.01)；與42 ℃熱應(yīng)激組相比，42℃+Pue組HSP70蛋白表達(dá)也顯著(P<0.05)增加(圖4)。

圖4 葛根素對(duì)SCs中HSP70蛋白表達(dá)的影響

3 討論

機(jī)體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生并不斷被清除，一旦出現(xiàn)應(yīng)激源，機(jī)體可產(chǎn)生大量的自由基[6]。研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可使豬睪丸細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)，并使生殖細(xì)胞脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)[2]，當(dāng)過氧化反應(yīng)超過抗氧化能力，則誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生脂類過氧化物，尤其是丙二醛，其過多產(chǎn)生會(huì)影響精子運(yùn)動(dòng)能力和受精能力[7]。生物體內(nèi)主要的抗氧化酶有超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激后SCs細(xì)胞存活率顯著降低，這可能與MDA含量增加以及細(xì)胞凋亡有關(guān)，SCs細(xì)胞受熱應(yīng)激后，細(xì)胞核皺縮濃染，凋亡率增加，同時(shí)抗氧化酶含量降低，說明熱應(yīng)激使牛睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。

近年來研究葛根素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用。提高細(xì)胞清除超氧陰離子的能力，從而發(fā)揮抗自由基損傷的作用[8]。葛根素可以增強(qiáng)心室乳頭肌內(nèi)SOD活性，降低MDA含量，通過清除自由基減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞作用[9]。此外，HSP70是細(xì)胞受到應(yīng)激后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，具有抗氧化，對(duì)過氧化氫所致乳鼠心肌細(xì)胞核仁損傷具有保護(hù)作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注后葛根素能夠顯著上調(diào)HSP70表達(dá)，抑制血清中過氧化物酶(MPO)活性，保護(hù)心肌。本研究表明一定濃度葛根素可顯著提高熱應(yīng)激細(xì)胞后SOD、GSH-Px和CAT活力，極顯著降低MDA含量，且與維生素E具有同樣的抗氧化效果。同時(shí)葛根素提高熱應(yīng)激處理SCs的HSP70蛋白表達(dá)，可以推斷葛根素對(duì)SCs的抗氧化損傷能力可能與HSP70的分子伴侶作用有關(guān)。

綜上所述，熱應(yīng)激能使牛睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，而葛根素可以有效緩解熱應(yīng)激所致的氧化應(yīng)激損傷，且其作用機(jī)制與葛根素能增加熱應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞抗氧化酶活性以及增加HSP70的表達(dá)有關(guān)。然而，葛根素的抗氧化作用機(jī)制以及在體內(nèi)葛根素是否有和在體外同樣的作用，還有待進(jìn)一步深入研究。

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Protective Effect of Puerarin on Heat Stress-inducedOxidative Damage in Bovine Sertoli Cells

CONG Xia1, ZHANG Dong-jun2, REN Ting-ting1, ZHANG Qian1, ZHU Li-ping1, LI Qi1,CAO Rong-feng1, TIAN Wen-ru1, LI Hua-tao1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109,China; 2.Veterinary and Animal Husbandry Department Feicheng, Feicheng 271600, China)

Puerarin(Pue)is a flavonoid extracted from traditional Chinese medicine Puerarin with obvious antioxidant effect. Whether Pue has the protective effect of Bovine Sertoil cells (SCs) on heat stress is still unclear. The cells were incubated with or without various concentrations of Pue, and then heat-stressed at 42℃ for 1 h and returned to 34℃ for 6h. Cell viability was decreased, and the apoptosis rate was increased and the cellular oxidative damage occurred after heat stress. However, the MDA content in the SCs treated with heat stress decreased significantly after Pue pretreatment.Also, the SOD, CAT and GSH-Px activities were significantly increased compared to heat stress group. There was no significant difference in the parameters determined above between Pue and VE pretreatment groups. Furthermore, Western-blot results showed that Pue significantly enhanced the expression of HSP70. Pue protects SCs from heat stress induced oxidative damage possibly by increasing activities of antioxidative enzymes and increased HSP70 expression.

Bovine Sertoli Cells; Puerarin; Heat stress; HSP70; Antioxidant enzyme activity

LI Hua-tao

2015-08-03

國家自然科學(xué)基金 (31572590, 31502138)；山東省自然科學(xué)基金(BS2015NY001)；山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目(J15LF03)

叢霞(1962- )，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,碩士，主要從事動(dòng)物生殖與生殖疾病研究，E-mail: wrtian@126.com

李華濤，E-mail: htli1986@hotmail.com

R285

A

0529-6005(2016)11-0043-03