中哈邊境阿拉山口口岸輸入性亞洲璃眼蜱的種類鑒定與分析

徐 軍 ， 王安東 ， 戴 莉 ， 楊 杰 ， 羅 丹 ，徐建軍 ， 李志遠(yuǎn) ， 熱依罕古麗 ， 薩尼葉古麗

(1.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 新疆烏魯木齊832000 ； 2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 新疆石河子832000 ；3.阿拉山口出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 新疆阿拉山口833418 ； 4.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 ， 新疆石河子832000 ；5.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 新疆烏魯木齊830052)

中哈邊境阿拉山口口岸輸入性亞洲璃眼蜱的種類鑒定與分析

徐 軍1， 王安東2， 戴 莉3， 楊 杰3， 羅 丹4，徐建軍5， 李志遠(yuǎn)2， 熱依罕古麗5， 薩尼葉古麗5

(1.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 新疆烏魯木齊832000 ； 2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 新疆石河子832000 ；3.阿拉山口出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 新疆阿拉山口833418 ； 4.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 ， 新疆石河子832000 ；5.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 新疆烏魯木齊830052)

對(duì)1批從哈薩克斯坦進(jìn)口羊毛中檢獲的蜱樣品進(jìn)行種類鑒定。應(yīng)用16S rDNA基因和COI基因兩條DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果16S rDNA序列分析顯示與新疆亞洲璃眼蜱(KC203351)同源性最接近(99%)；COI基因序列分析顯示與新疆伊犁亞洲璃眼蜱(KF527440)同源性最接近(99%)。結(jié)論：經(jīng)DNA條形碼比對(duì)，確定為亞洲璃眼蜱，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)外來醫(yī)學(xué)媒介生物防控，嚴(yán)防“外來病”入侵。

亞洲璃眼蜱 ； 種類鑒定 ； 16S RNA ； COI ； 線粒體 ； 阿拉山口口岸

羊毛和毛皮是紡織服裝和毛皮行業(yè)的重要生產(chǎn)原料，我國(guó)毛紡織工業(yè)和毛皮行業(yè)快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)羊毛和毛皮原料供不應(yīng)求，每年需從國(guó)際市場(chǎng)購(gòu)進(jìn)大量羊毛和毛皮。羊毛夾帶是檢疫監(jiān)管中老大難問題。有文獻(xiàn)顯示，羊毛能攜帶炭疽、小反芻獸疫、布魯菌等動(dòng)物傳染病的病原體、媒介生物和植物種子等[1]。利用傳統(tǒng)方法分析蜱種的系統(tǒng)進(jìn)化具有很大局限性，尤其體現(xiàn)在以下情況：形態(tài)學(xué)特征很相似的物種、標(biāo)本破壞、缺乏未成蜱的性狀描述或采集的標(biāo)本為飽血個(gè)體。隨著研究技術(shù)的飛速發(fā)展，DNA 條形碼技術(shù)為物種鑒定、種群研究及系統(tǒng)進(jìn)化分析提供了有效途徑[2]。本研究嘗試使用DNA 條形碼技術(shù)，對(duì)入境羊毛夾帶的殘缺蜱進(jìn)行種類鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料 2015 年從哈薩克斯坦進(jìn)境的一批羊毛夾帶中檢出一批蜱，共23只，樣本損壞嚴(yán)重，無法鏡檢。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit 說明書，進(jìn)行DNA 提取(1只/份)，將提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)張璘[2]，Rees D J[3]已經(jīng)報(bào)道的16S rDNA、COI 序列進(jìn)行PCR。引物序列及其相應(yīng)擴(kuò)增條件見表1。50 μL PCR 反應(yīng)體系包含如下成分：25 μL 2×TaqPCR Master Mix，1 μL 10 mmol/L 上游引物，1 μL 10 mmol/L 下游引物，2 μL DNA模板，21 μL ddH2O。

表1 引物及其反應(yīng)條件

1.2.3 序列分析及分子遺傳進(jìn)化分析 將PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中進(jìn)行Blast進(jìn)行同源性分析，然后使用Mega6.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 通過PCR擴(kuò)增上述23只蜱樣本線粒體DNA，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均獲得特異性很好的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期目的片段一致(圖1)。

圖1 蜱16S rDNA和COI PCR電泳結(jié)果

M：DNA Marker ；左1～3：蜱樣本16S rDNA PCR產(chǎn)物；右1～3：蜱樣本COI PCR產(chǎn)物

2.2 DNA條形碼技術(shù)分析 經(jīng)測(cè)序，16Sr DNA基因測(cè)得21條序列，COI基因測(cè)得21條序列。DNAMAN分析顯示，16S RNA和COI基因序列之間存在多樣性，16S rDNA可以獲得6個(gè)不同序列(KU183532-KU183537)，COI可以獲得17個(gè)不同序列(KU364317-KU364334)。經(jīng)Blast分析，所有蜱樣本均與亞洲璃眼蜱同源性最高。其中，16Sr DNA序列顯示與新疆亞洲璃眼蜱(KC203351)同源性最接近(99%)；COI基因序列顯示與新疆尉犁亞洲璃眼蜱(KF527440)同源性最接近(99%)。從分子系統(tǒng)發(fā)育樹最大似然分析可知，16Sr DNA基因序列與亞洲璃眼蜱(KC203351，新疆)(KP400549，新疆阿拉山口)(KF527439，新疆尉犁)(JX051092，內(nèi)蒙古)聚為一支，COI基因序列與亞洲璃眼蜱(KF527440，新疆尉犁)(JQ737073，甘肅)(JQ737070，新疆)(JX051141，內(nèi)蒙古)(KF583578，新疆)聚為一支。

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，蜱的分子分類學(xué)鑒定開始應(yīng)用并發(fā)展起來[4-5]在蜱類物種鑒定和系統(tǒng)研究中起了非常重要的作，用。16S rDNA是動(dòng)物線粒體較保守的基因，進(jìn)化速率緩慢，以替換為主，可用保守引物或通用引物定位并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；COI基因是線粒體蛋白編碼基因之一，可以自由變異，且COI的演化速率是其他蛋白編碼基因的3倍，有足夠的變異能夠?qū)⑽锓N區(qū)別開來，COI 還具有較少的插入和缺失，兩端序列有相對(duì)的保守性的特點(diǎn)，是較好的分子標(biāo)記[2]。本研究通過使用16SrDNA和COI兩條DNA條形碼，成功對(duì)從哈薩克斯坦輸入性亞洲璃眼蜱進(jìn)行分子鑒定，對(duì)加強(qiáng)口岸醫(yī)學(xué)媒介的查驗(yàn)和監(jiān)測(cè)有較大的指導(dǎo)意義。由此可見：DNA條形碼能夠準(zhǔn)確、快速地鑒定外來蜱種，為口岸地區(qū)蜱類鑒定提供新思路。

2008年阿拉山口出入境檢驗(yàn)檢疫局在3批哈薩克斯坦國(guó)進(jìn)口的牛皮中連續(xù)亞洲璃眼蜱、殘緣璃眼蜱和盾糙璃眼蜱[6]，本次在哈薩克斯坦進(jìn)口羊毛夾帶中檢出亞洲璃眼蜱。因此，硬蜱在阿拉山口口岸進(jìn)口動(dòng)物產(chǎn)品中具有較高的輸入風(fēng)險(xiǎn)。亞洲璃眼蜱主要生活在荒漠或半荒漠地區(qū)，通常寄生于駱駝，牛，馬，羊等家畜以及刺猬，野兔等，也侵襲人。哈薩克斯坦地處歐亞大陸中部，共有4個(gè)自然帶：森林草原帶、草原帶、沙漠帶和半沙漠帶[7]，哈薩克斯坦自然環(huán)境與我國(guó)新疆十分相似。加之亞洲璃眼蜱是新疆出血熱病原體的攜帶者，此外，該蜱還能自然感染Q熱，北亞蜱媒斑點(diǎn)熱、蜱媒腦炎等，并是牛環(huán)形泰勒蟲的傳播媒介[8]。Tumanova IIu在 2001-2003年對(duì)哈薩克斯坦和塔吉克斯坦的亞洲璃眼蜱、小亞璃眼蜱和銀盾革蜱中克里米亞-剛果出血熱病毒監(jiān)測(cè)中首次發(fā)現(xiàn)哈薩克斯坦存在非洲樣的克里米亞-剛果出血熱病毒[9]。因此，一旦活亞洲璃眼蜱隨動(dòng)物產(chǎn)品輸入新疆，將會(huì)定居繁殖，并對(duì)新疆當(dāng)?shù)厝撕图倚笤斐晌：Α?/p>

阿拉山口作為“一路一帶”向西開放的橋頭堡，國(guó)外大量牛、羊、皮毛從口岸借助交通工具攜帶媒介生物入境，增加了蟲媒病傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)口岸地區(qū)媒介生物的檢測(cè)，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)入境易染動(dòng)物及其產(chǎn)品的監(jiān)督監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格消毒，嚴(yán)防“外來病”的入侵。

[1] 顧志軍，徐金祥，沈濤，等.進(jìn)境羊毛有害生物防控及監(jiān)管措施探討[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2008(1)：56-58.

[2] 張璘.新疆北疆地區(qū)蜱種分布及蜱源性病原檢測(cè)方法的建立[D].石河子：石河子大學(xué)，2014：47-48.

[3] Rees D J，Dioli M，Kirkendall L R.Molecules and morphology：evidence forcryptichybridization in African Hyalomma(Acari：Ixodidae)[J].Mol PhylogenetEvo，2003，27(1)：131-142.

[4] Zahler M，F(xiàn)ilippova N A，Morel P C，etal.Relationships between species of the Rhipicephalus sanguineus group：A molecular appmach[J].J Parasitol，1997，83(2)：302-306．

[5] Dobson S J，Barker S C.Phylogeny of the hard ticks(Ixedidae)inferred from 18S rRNA indicates that the genus Aponommais paraphyletic[J].Mol Phylogenet Evol，1999，11(2)：288-295.

[6] 尹小平，葉志輝，嬌娃，等.阿拉山口口岸地區(qū)蜱類區(qū)系調(diào)查及宿主動(dòng)物染帶關(guān)系監(jiān)測(cè)分析[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2010，21(4)：375-377.

[7] 中華人民共和國(guó)駐哈薩克斯坦共和國(guó)大使館經(jīng)濟(jì)商務(wù)參贊處.哈薩克斯坦的農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)[EB/OL].[2004-03-19].

[8] 劉繼榮，米來，王平福，等.準(zhǔn)噶爾盆地硬蜱區(qū)系考察與名錄記述[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2013，21(1)：60-65.

[9] Tumanova IIu，Seregin S V，Vyshemirskii O I，etal.Genetic monitoring of the Crimean-Congo Hemorrhagic Fever virus in Kazakhstan and Tajikistan in 2001-2003[J].Mol Gen Mikrobiol Virusol，2006(2)：36-41.

Species identification of an imported tick sample ofHyalommaasiaticumasiaticum by genetic analysis at Alashankou port，China- Kazakhstan border

XU Jun1， WANG An-dong2， DAI Li3， YANG Jie3， LUO Dan4，XU Jian-jun4， LI Zhi-yuan2， RE Yi-han-gu-li5， SA Ni-ye-gu-li5

(1.Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Urumqi 830000，China ；2.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000，China ； 3.Alashankou Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Alashankou 833418，China ； 4.College of Veterinary Medicine，Shihezi University，Shihezi 830052，China ；5.College of Veterinary Medicine ， XND ， Urumqi 830052，China)

To identify the species of ticks in wool samples from Kazakhstan at Alashankou port，Xinjiang Uygur Autonomous Region，China.The 16S rDNA and CO1 identification were carried out for the ticks，and sequence analysis was performed to establish the molecular phylogenetic tree.The 16S rDNA and COI were clustered together withHyalommaasiaticumasiaticum(accessionnumbers：KC203351，KF527440)；these strains had the highest homology withHyalommaasiaticumasiaticum(99%).Based on DNA barcode comparison，the imported tick sample was identified asHyalommaasiaticumasiaticum. We should strengthen the prevention and control of imported medical vectors，to prevent the "Exotic Diseases".

Hyalommaasiaticumasiaticuma； Speciesi dentification ； 16S rDNA ； COI gene ； Alashankou Port ； China-Kazakhstan border

2015-11-05

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(201442137-1)；國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014IK239)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103008)

徐軍(1969-)，男，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物檢驗(yàn)工作，E-mail：alskxj@sina.com

王安東(1990-)，男，碩士生，從事獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督與管理研究工作，E-mail：wadshzu@163.com

Q969

A

0529-6005(2016)11-0017-02

注：王安東與徐軍對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)