益生菌對(duì)新城疫疫苗免疫雛雞免疫器官T細(xì)胞增殖能力和IL-2 mRNA表達(dá)影響

白 玉 ， 李 琰 ， 高雪麗 ， 劉超男 ， 呂曉萍 ， 鄭世民

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2. 四川省畜牧科學(xué)研究院， 四川成都610066)

益生菌對(duì)新城疫疫苗免疫雛雞免疫器官T細(xì)胞增殖能力和IL-2 mRNA表達(dá)影響

白 玉1， 李 琰2， 高雪麗1， 劉超男1， 呂曉萍1， 鄭世民1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2. 四川省畜牧科學(xué)研究院， 四川成都610066)

為探索益生菌對(duì)新城疫(ND)疫苗免疫雛雞的免疫效果影響。 將100只1日齡AA肉雞隨機(jī)分為益生菌組、 ND疫苗單獨(dú)免疫組、 益生菌聯(lián)合ND疫苗應(yīng)用組和空白對(duì)照組。 采用MTT法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各試驗(yàn)雛雞于ND疫苗兩次應(yīng)用后0、 7、 14、 28、 42 d胸腺、 脾臟中細(xì)胞免疫功能及IL-2 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后， 其胸腺和脾臟中T細(xì)胞增殖能力和IL-2 mRNA表達(dá)， 分別于ND疫苗免疫后7～28 d明顯(P<0.05或P<0.01)高于ND疫苗或益生菌單獨(dú)應(yīng)用雛雞。 表明益生菌可通過提高雛雞免疫器官中T細(xì)胞增殖功能和IL-2 mRNA表達(dá)， 發(fā)揮增強(qiáng)ND疫苗免疫效應(yīng)作用。

益生菌 ； 新城疫疫苗 ； T細(xì)胞增殖能力 ； 白細(xì)胞介素-2 mRNA表達(dá)

益生菌是活的，有助于機(jī)體腸道微生物區(qū)系平衡和健康的無致病性細(xì)菌，通過在機(jī)體腸道內(nèi)與致病菌頡頏、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等作用促進(jìn)動(dòng)物生長、發(fā)育，保障動(dòng)物健康[1]。目前，抗生素的不正當(dāng)使用，尤其是濫用造成超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生和嚴(yán)重的藥物殘留等問題，不但已引起了廣大學(xué)者的高度關(guān)注，在某方面也得到了許多國家政府的高度重視，故探索或?qū)ふ倚兄行У目股靥娲芬恢笔强萍脊ぷ髡吲Φ姆较蚝脱芯繜狳c(diǎn)之一[2]。益生菌所具有的安全可靠，無毒副作用，無耐藥殘留等生物特性而得到學(xué)者的高度重視[3]。綜合目前已有研究資料，對(duì)益生菌與疫苗聯(lián)合應(yīng)用方面的系統(tǒng)研究較少，故本試驗(yàn)旨通過T細(xì)胞對(duì)ConA增殖和IL-2 mRNA表達(dá)的檢測，在細(xì)胞水平與mRNA水平闡述益生菌和ND疫苗聯(lián)合免疫雛雞后，其對(duì)雛雞免疫器官細(xì)胞免疫功能的影響，為益生菌在動(dòng)物醫(yī)學(xué)界應(yīng)用提供試驗(yàn)理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡AA肉雞100只，雌雄各半，購自哈爾濱市某孵化場，經(jīng)NDV、MDV、IBDV等檢測均為陰性。

1.2 益生菌 產(chǎn)酶益生菌，購自山東華爾康生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為飼添字(2007)11178號(hào)，按產(chǎn)品說明書使用。

1.3 ND疫苗 LaSota弱毒苗(Ⅳ系)，購自哈藥集團(tuán)生物制品一廠，批號(hào)為200861， 按說明書使用。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 100只雛雞隨機(jī)分為4組，即益生菌組(P組)、ND疫苗單獨(dú)免疫組(V組)、益生菌聯(lián)合ND疫苗組(P+V組)和空白對(duì)照組(C組)。其中，P組和P+V組雛雞分別在1日齡和18日齡連續(xù)灌服益生菌稀釋液3 d，1次/天(0.1mL/次，5×109CFU/mL)；V組和P+V組雛雞分別在10日齡和21日齡經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼接種LaSota弱毒苗，且21日齡免疫劑量為10日齡的2倍；C組雛雞灌服生理鹽水。

1.5 被檢材料采取及處理 4組雛雞分別于第二次接種LaSota疫苗后0、7、14、28、42 d，每組隨機(jī)抽取5只雛雞，心臟采血處死，無菌快速采取胸腺、脾臟一部分制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行組織細(xì)胞培養(yǎng)，用于T細(xì)胞增殖能力檢測；另一部分于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中凍存，用于IL-2 mRNA 表達(dá)檢測。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 胸腺、脾臟T細(xì)胞增殖能力的檢測 胸腺、脾臟T細(xì)胞增殖能力檢測，采用細(xì)胞培養(yǎng)及MTT檢測法[4]，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上，測定590nm下的OD值。

1.6.2 雞免疫器官IL-2 mRNA表達(dá)量的檢測 雞IL-2 mRNA表達(dá)量測定，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[5]。

2.結(jié)果

2.1 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后胸腺、脾臟T細(xì)胞增殖能力變化 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后，其胸腺和脾臟中T細(xì)胞增殖能力與ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞和益生菌單獨(dú)應(yīng)用雛雞相比均不同程度升高，其中胸腺T細(xì)胞增殖能力于疫苗免疫后 7～28 d顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞及益生菌單獨(dú)應(yīng)用雛雞；脾臟中T細(xì)胞增殖能力分別于疫苗免疫后7～14 d和7～28 d顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞和益生菌單獨(dú)應(yīng)用雛雞(圖1，2)。

圖1 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后胸腺T 細(xì)胞增殖能力變化

圖2 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后脾臟T細(xì)胞增殖能力變化

2.2 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后胸腺、脾臟IL-2 mRNA表達(dá)量變化 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后，其胸腺、脾臟IL-2 mRNA表達(dá)量于疫苗免疫后7～14 d顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞，于7～28 d也明顯(P<0.05或P<0.01)高于益生菌單獨(dú)應(yīng)用雛雞(圖3，4)。

3.討論

T細(xì)胞在雛雞體內(nèi)主要集中在胸腺和脾臟中，T細(xì)胞不僅可以直接殺傷靶細(xì)胞，還可調(diào)節(jié)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對(duì)特異性抗原和有絲分裂原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時(shí)T細(xì)胞還能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如IL-2INF-γ等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后，其胸腺和脾臟中T細(xì)胞對(duì)ConA的增殖能力較ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞和益生菌單獨(dú)應(yīng)用雛雞均有不同程度的增強(qiáng)，產(chǎn)生上述結(jié)果的可能原因是：雛雞飼喂益生菌后，益生菌在機(jī)體腸道中定植，合成大量維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)機(jī)體免疫器官發(fā)育及功能的發(fā)揮，使胸腺和脾臟中T細(xì)胞對(duì)有絲分裂原的反應(yīng)能力增強(qiáng)。Filho等[6]研究發(fā)現(xiàn)，雛雞飼喂嗜酸性乳酸桿菌后，其腸道黏膜中CD8+T細(xì)胞和Th2細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照雛雞；另外，益生菌其自身可作為抗原物質(zhì)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，激發(fā)免疫應(yīng)答，T細(xì)胞又是機(jī)體細(xì)胞免疫的主要免疫活性細(xì)胞，其免疫應(yīng)答功能的增強(qiáng)，表明動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞免疫功能提高；益生菌菌體的肽聚糖和脂多糖等成分，以免疫佐劑形式作用于機(jī)體免疫器官，促進(jìn)機(jī)體的免疫反應(yīng)，所以當(dāng)雛雞飼喂益生菌后，機(jī)體處于高水平的免疫反應(yīng)狀態(tài)，LaSota弱毒苗(Ⅳ系)免疫雛雞后，機(jī)體發(fā)生高水平的免疫反應(yīng)，使T細(xì)胞增殖較ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞更加顯著。

圖3 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后胸腺IL-2 mRNA表達(dá)變化

圖4 益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后脾臟IL-2 mRNA表達(dá)變化

益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后，其免疫器官中IL-2 mRNA表達(dá)均高于ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞，說明益生菌不僅可以提高雛雞免疫器官中T細(xì)胞增殖能力，還可促進(jìn)雛雞免疫器官IL-2 mRNA表達(dá)，其主要原因是：IL-2主要由Th1、Tc和NK細(xì)胞產(chǎn)生，雛雞飼喂益生菌后，其菌體成分，如肽聚糖具有免疫刺激活性，可促進(jìn)雛雞體內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌IL-1，而后者可活化Th細(xì)胞，使其分泌大量IL-2，故益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞的免疫器官中IL-2 mRNA表達(dá)高于ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞，而IL-2又可作用于T細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)物，促進(jìn)T細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。胸腺含有大量T細(xì)胞，所以飼喂益生菌雛雞，其胸腺中T細(xì)胞增殖效果更加明顯，且IL-2 mRNA表達(dá)量也顯著增加。于志強(qiáng)等[7]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后，其黏膜免疫器官中IL-2 mRNA表達(dá)均高于單獨(dú)應(yīng)用ND疫苗免疫雛雞及對(duì)照雛雞，本研究結(jié)果與上述已有研究報(bào)道基本一致。

綜上所述，益生菌聯(lián)合ND疫苗免疫雛雞后，其胸腺、脾臟中T細(xì)胞增殖能力和IL-2 mRNA表達(dá)與ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞和飼喂益生菌雛雞相比均明顯增加，說明益生菌能夠提升機(jī)體免疫能力，益生菌聯(lián)合疫苗免疫雛雞的免疫效果顯著優(yōu)于疫苗和益生菌單獨(dú)應(yīng)用雛雞。

[1] Giannenas I，Papadopoulos E，Tsalie E，etal．Assessment of dietary supplementation with probiotics on performance，intestinal morphology and microflora of chickens infected with Eimeria tenella[J]．Veterinary Parasitology，2012，188：31-40．

[2] Pan S J，Kuo C H，Lam K P，etal．Probiotics and allergy in children-an update review[J]．Pediatr Allergy Immunol，2010，21(42)：659-666．

[3] Zamith-Miranda D，Palma M L，Matos G S，etal．Lipid droplet levels vary heterogeneously in response to simulated gastrointestinal stresses in different probioticSaccharomycescerevisiaestrains[J]．Journal of Functional Foods，2016，21：193-200．

[4] 王彥，王長征．MTT法檢測卵蛋白刺激哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖最佳試驗(yàn)條件的研究[J]．毒理學(xué)雜志，2014，28(3)：170-172．

[5] 呂曉萍，申海龍，鄭世民．雞白細(xì)胞介素-2 mRNA表達(dá) SYBR GREEN1 Real-time PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J]．中國家禽，2015，37(2)：21-25．

[6] Filho R A，Díaz S J，F(xiàn)ernando F S，etal．Immunomodulatory activity and control of Salmonella Enteritidis colonization in the intestinal tract of chickens by Lactobacillus based probiotic[J]．Veterinary Immunology and Immunopathology，2015，167：64-69．

[7] 于志強(qiáng)，呂曉萍，高雪麗，等．益生菌及其聯(lián)合新城疫疫苗免疫雛雞局部黏膜組織IL-2 mRNA表達(dá)的變化[J]．中國獸醫(yī)雜志，2014，50(2)：20-23．

Influence of Probiotcs on T cell Proliferation Function and IL-2 mRNA Expression in Immune Organs of Chicks Vaccinated with Newcastle Disease Vaccine

BAI Yu1， LI Yan2， GAO Xue-li1， LIU Chao-nan1， LV Xiao-ping1， ZHENG Shi-min1

(1.College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural University， Harbin 150030, China ；2.Sichuan Animal Science Academy， Chengdu 610066， China)

In order to explore the effects of probiotics on the immune response in chicks vaccinated with Newcastle disease(ND)vaccine, 100 1-day-old AA broilers were randomly divided into probiotics alone group, ND vaccine alone immune group, probiotics and ND vaccine combination group, and blank control group. Test samples of chicks in each group after ND vaccination were collected at 0,7,14,28,and 42 days post vaccination. The cellular immune function and IL-2 mRNA expression in thymus and spleen of probiotics-fed chicks vaccinated with ND vaccine were detected by MTT and RT-PCR. The results showed that the proliferation function of T cell in thymus and spleen of probiotics-fed chicks vaccinated with ND vaccine were significanty higher(P<0.05 orP<0.01)than vaccination alone or probiotics-fed chicks at 7～28 days after vaccination. These data show that probiotics can enhance the immune efficacy of ND vaccine by enhancing the proliferation of T cells and IL-2 mRNA expression in thymus and spleen of chicks.

probiotic; Newcastle disease vaccine; proliferation function of T cell; IL-2 mRNA expression

ZHENG Shi-min

2016-03-25

國家自然科學(xué)基金(30972162)

白玉(1991- )，男，碩士生，主要從事動(dòng)物免疫病研究，E-mail：baiyu618@sohu.com

鄭世民，E-mail：zhenghsiminbl@sohu.com

S852.33

A

0529-6005(2016)11-0001-03