CD73在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及與腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

馬思宇，王瑛韜，狄 娜，王瑛堅(jiān)*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130033;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 藥劑科)

CD73在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及與腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

馬思宇1，王瑛韜2，狄 娜1，王瑛堅(jiān)1*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130033;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 藥劑科)

目的 檢測(cè)卵巢上皮性癌中CD73的表達(dá)情況及微血管計(jì)數(shù)值，探討CD73與卵巢上皮性癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 利用免疫組化法及微血管計(jì)數(shù)法，檢測(cè)正常卵巢組織，卵巢上皮性囊腺瘤，卵巢交界性上皮性囊腺瘤，卵巢上皮性囊腺癌中CD73的表達(dá)情況及微血管計(jì)數(shù)。分析卵巢上皮性癌中CD73表達(dá)程度及MVD計(jì)數(shù)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，并分析二者之間的關(guān)系。結(jié)果 卵巢上皮性癌組織中CD73的表達(dá)程度及MVD計(jì)數(shù)均高于良性組及交界組(P<0.05)，二者與患者年齡、組織學(xué)分型無(wú)關(guān)，與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)浸潤(rùn)、腹水及腹腔沖洗液中癌細(xì)胞相關(guān)，并且二者之間的表達(dá)正相關(guān)。結(jié)論 CD73在腫瘤的發(fā)生機(jī)制中起到一定的作用；CD73與惡性腫瘤嚴(yán)重程度正相關(guān)，有望作為一個(gè)新的評(píng)估卵巢上皮性癌病情進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo)，為基因的靶向治療提供了新的思路。

卵巢上皮性癌；CD73；免疫組化；微血管密度

(ChinJLabDiagn,2016,20:2037)

CD73是一種跨膜糖蛋白，在生物體內(nèi)參與胞外腺苷酸轉(zhuǎn)化為腺苷的生物學(xué)過程，并且在這一過程中起到關(guān)鍵酶的作用[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，CD73在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，在惡性腫瘤的形成、侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤能夠在其轉(zhuǎn)移部位的成功生長(zhǎng)，有賴于腫瘤新生血管的供應(yīng)作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，微血管密度(MVD)是腫瘤樣血管增生的定量指標(biāo)，有報(bào)道指出在一些腫瘤中，MVD計(jì)數(shù)升高與腫瘤較差的預(yù)后存在著聯(lián)系[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在利用檢測(cè)CD73的表達(dá)情況及MVD計(jì)數(shù)，探討CD73在卵巢上皮性癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，為卵巢上皮性癌的惡性程度的評(píng)價(jià)及預(yù)后評(píng)估提供一定的參考依據(jù)，以及能否通過抑制CD73的表達(dá)，為未來的基因靶向治療提供一定的理論依據(jù)及新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院和長(zhǎng)春市醫(yī)院2014年1月至2015年12月間手術(shù)切除的組織標(biāo)本，其中因其它疾病切除的正常卵巢組織20例、卵巢良性上皮性腫瘤組織20例、卵巢交界性上皮性腫瘤39例和卵巢上皮性癌組織84例。所有患者術(shù)前均未行放療、化療和激素治療，亦未合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤?；颊吣挲g在32-77歲之間，平均年齡46.2±6.5歲；臨床分期(FIGO.2013)，I-II期34例，III-IV期50例；組織學(xué)分級(jí)，G1 19例，G2 26例，G3 39例；組織學(xué)分型，漿液性58例，粘液性26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，無(wú)轉(zhuǎn)移者54例；有36例患者的腹水或腹腔沖洗液中有癌細(xì)胞，48例未發(fā)現(xiàn)。

1.2 材料與方法

1.2.1 主要試劑 CD73(Mouse CD73 antibody)免疫組化染色試劑盒(艾博抗上海)；CD34(Mouse anti-CD34)免疫組化染色試劑組盒(北京中杉金橋)。

1.2.2 方法 所有選取標(biāo)本均為新鮮取材，并立即于10%中性福爾馬林溶液中固定，完成后經(jīng)石蠟包埋、切片、免疫組化染色、HE染色。以試劑盒內(nèi)已知的陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)CD73的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用CD34對(duì)腫瘤新生血管進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 CD73的結(jié)果判定 CD73陽(yáng)性表達(dá)為：鏡下在卵巢上皮細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)細(xì)胞胞膜或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。切片評(píng)分采用綜合評(píng)分法，①根據(jù)病變區(qū)域的普通染色強(qiáng)度記分：無(wú)著色或淡黃色，計(jì)為1分；細(xì)胞著色為棕黃色，計(jì)為2分；細(xì)胞明顯著色為棕褐色，計(jì)為3分；②根據(jù)病變區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比記分：隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)0%-10%為1分；10%-50%為2分；50%-100%為3分。以上兩項(xiàng)評(píng)分相乘積為最終綜合評(píng)分。評(píng)分1-3分判定為低表達(dá)；評(píng)分4分以上判定為高表達(dá)[3]，其中4分為強(qiáng)度I級(jí)，6分為強(qiáng)度II級(jí)，9分為強(qiáng)度III級(jí)。

1.3.2 MVD的判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用CD34標(biāo)記微血管。血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿著色為棕黃色，并且孤立或成團(tuán)簇出現(xiàn)，只要其與臨近微血管、腫瘤細(xì)胞或其它結(jié)締組織分開，就把它們作為一個(gè)微血管。根據(jù)Weidner[4]計(jì)數(shù)方法，高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野的微血管數(shù)，取平均值為間質(zhì)微血管密度。單個(gè)著色的內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞叢均按獨(dú)立血管計(jì)數(shù)；管腔較大且有較厚肌層或管腔內(nèi)有8個(gè)以上紅細(xì)胞者，不在計(jì)數(shù)之列。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

顯著性檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；各組間MVD計(jì)數(shù)均數(shù)比較用t檢驗(yàn)處理；CD73表達(dá)情況與MVD計(jì)數(shù)的相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行分析。結(jié)果以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織中的CD73表達(dá)情況及MVD計(jì)數(shù)

CD73在卵巢上皮性癌中的陽(yáng)性表達(dá)程度及MVD計(jì)數(shù)值明顯高于正常卵巢、良性和交界性上皮性卵巢腫瘤。提示CD73表達(dá)上調(diào)及腫瘤血管新生可能在卵巢上皮性癌的發(fā)生中起重要作用。(見表1)。

表1 在不同卵巢組織的中CD73的表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)

注：比較CD73高表達(dá)率，正常組、良性組、交界性組3組間相互比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，此3組 與惡性組比較均有顯著性差異(P<0.001)。各組間相互比較 MVD計(jì)數(shù)，P均<0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 CD73腫瘤上皮細(xì)胞典型及異質(zhì)性染色 雙盲評(píng)分4分(SP×400)高表達(dá)Ⅰ級(jí) 圖2 CD73腫瘤上皮細(xì)胞膜典型著色雙盲評(píng)分6分(SP×400)高表達(dá)Ⅱ級(jí) 圖3 CD73腫瘤上皮細(xì)胞膜典型著色雙盲評(píng)分9分(SP×400) 高表達(dá)Ⅲ級(jí)

2.2 卵巢上皮性癌組織中CD73的表達(dá)情況、MVD計(jì)數(shù)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

CD73陽(yáng)性表達(dá)程度與MVD計(jì)數(shù)值與卵巢上皮性癌的多種病理學(xué)參數(shù)呈正向關(guān)系，臨床分期越晚、組織分化程度越低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水及腹腔沖洗液中有癌細(xì)胞者，CD73的陽(yáng)性表達(dá)程度及MVD計(jì)數(shù)值越高。兩者均與卵巢上皮性癌患者的年齡及病理學(xué)類型無(wú)關(guān)。(見表2)

表2 CD73陽(yáng)性表達(dá)程度、MVD計(jì)數(shù)與臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系

2.3 卵巢上皮性癌組織中CD73的陽(yáng)性表達(dá)情況與MVD計(jì)數(shù)的關(guān)系

在卵巢上皮性癌患者中，MVD與CD73的表達(dá)程度呈正相關(guān)(r=0.914，P<0.001)。(見表3)

表3 卵巢上皮性癌組織中CD73的陽(yáng)性表達(dá)情況與MVD計(jì)數(shù)的關(guān)系

注：r=0.914，P<0.001

3 討論

卵巢癌是女性最常見的致死性女性惡性生殖系統(tǒng)腫瘤之一，患者的5年生存率較低。隨著近年來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，尋找基因水平的靶向治療已成為研究的熱點(diǎn)。CD73，又稱胞外-5’-核苷酸酶，參與細(xì)胞的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮多種生物學(xué)作用[1]。CD73是具有酶活性的核苷酸，能夠催化腺苷酸水解成為腺苷。生理狀態(tài)下，小劑量的腺苷具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)CD73在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，在惡性腫瘤的形成、侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤新生血管的形成對(duì)于腫瘤的新生、轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。MVD是腫瘤樣血管增生的定量指標(biāo)，有報(bào)道指出在一些腫瘤中，高表達(dá)的MVD與腫瘤較差的預(yù)后存在著聯(lián)系。CD34能夠在未成熟及內(nèi)皮腔細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，標(biāo)記腫瘤新生血管，CD34較其他因子具有更高的特異性及敏感性，是最有效指標(biāo)[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮性癌組織中CD73的表達(dá)程度及MVD計(jì)數(shù)均高于良性組及交界組(P<0.05)，二者與患者年齡、組織學(xué)分型無(wú)關(guān)，與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)浸潤(rùn)、腹水及腹腔沖洗液中癌細(xì)胞相關(guān)，并且二者之間的表達(dá)正相關(guān)。研究表明卵巢上皮性癌組織內(nèi)普遍缺氧，而當(dāng)組織處于缺血、缺氧的病理狀態(tài)時(shí)，CD73表達(dá)上調(diào)[5]，導(dǎo)致腺苷生成增多，可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞釋放高水平的血管生成誘導(dǎo)因子，這些因子的增多可促進(jìn)腫瘤血管的新生，誘導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)。還可以增加細(xì)胞的遷移、增殖和管腔形成的能力，有潛在的促進(jìn)血管生成的作用。同時(shí)可以增加血管生成因子的旁分泌作用，直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤血管的新生[6]。另外，CD73的酶活性可直接上調(diào)多種血管生成因子的表達(dá)，下調(diào)多種血管生成抑制因子的表達(dá)，破壞二者之間的平衡狀態(tài)，直接促進(jìn)腫瘤血管的新生。CD73同時(shí)具有非酶活性，可以直接參與影響炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，發(fā)揮促進(jìn)免疫逃逸、免疫抑制的病理學(xué)功能。阻礙了機(jī)體對(duì)于腫瘤細(xì)胞的正常免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[5，6]。

國(guó)內(nèi)外已有多項(xiàng)抑制CD73在惡性腫瘤中表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)，用CD73 單克隆抗體或多克隆抗體阻斷小鼠乳腺癌細(xì)胞CD73的功能[16]，可顯著抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)及癌癥的肺轉(zhuǎn)移。腫瘤的分子靶向治療相對(duì)于普通的化學(xué)藥物治療具有更高的特異性、安全性，然而適用于臨床治療的靶向藥物少之又少，用CD73單克隆抗體或多克隆抗體技術(shù)、小干擾RNA技術(shù)來阻斷CD73表達(dá)，使其功能缺失，對(duì)于腫瘤治療至關(guān)重要，因此CD73有望成為基因治療的新靶點(diǎn)，為基因靶向治療提供新的思路，值得進(jìn)一步研究[7]。

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[4]WeidernerN.Tumou ralvascularity as a prognostic factor in cancer patients:the evidence continues to grow [J].J Pathol,1998,184:119.

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The expression of CD73 in epithelial ovarian tumor and relevant research of tumor growth and transfer

MASi-yu,WANGYing-tao,DINa,etal.

(China-JapanUnianHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective Researched the CD73 expresssion level and microvessel density in epithelial ovarian carcinoma tissues.And discuss the relationship between CD73 and the occurrence,development and transfer of epithelial ovarian cancer.Methods Using immunohistochemistry and microvessel counting method,detect expression of CD73 and microvessel count of normal ovarian tissues,ovarian cystadenoma,borderline ovarian cystadenoma,epithelial ovarian cystadenocarcinoma.Analysis the relationship between CD73 expression level and MVD with parameters and clinical pathology in ovarian epithelial carcinoma,and analyze the relationship between they two.Results In epithelial ovarian cancer tissues CD73 expression and MVD are higher than those in benign and borderline group (P< 0.05),independent of patients?age,histological type,but dependent of clinical stage,histological grade,lymph node metastasis and cancer cells in ascites and peritoneal flushing fluid,and CD73 expression and MVD are positively correlated.Conclusion CD73 plays a role in the pathogenesis of tumor.CD73 was positively correlated with the severity of malignancy,could be used as indicators of new assessment of disease progression and prognosis of ovarian epithelial cancer and new ideas of gene targeted therapy .

Epithelial ovarian carcinoma；CD73；Immunohistochemical stain；Microvessel density

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：20140414018GH)

1007-4287(2016)12-2037-04

R737.31

A

2016-03-04)

*通訊作者