云南337名非綜合征型聾患者GJB3基因C538T和G547A突變分析

李彥瓊,劉德勝,呂超紹,李 麗,鄭永欽,左榮霞,撒亞蓮*

(1.昆明理工大學附屬醫(yī)院(云南省第一人民醫(yī)院)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，云南省出生缺陷與遺傳病研究重點實驗室，云南 昆明650032；2.四川省中醫(yī)院 急診科，四川 成都610075)

云南337名非綜合征型聾患者GJB3基因C538T和G547A突變分析

李彥瓊1,劉德勝2,呂超紹1,李 麗1,鄭永欽1,左榮霞1,撒亞蓮1*

(1.昆明理工大學附屬醫(yī)院(云南省第一人民醫(yī)院)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，云南省出生缺陷與遺傳病研究重點實驗室，云南 昆明650032；2.四川省中醫(yī)院 急診科，四川 成都610075)

目的 探討云南省部分特教學校聾生攜帶GJB3基因C538T和G547A的突變率。方法 采集337名非綜合征型耳聾學生及150名健康人群的外周靜脈血，提取基因組DNA，PCR擴增含GJB3基因C538T和G547A的基因片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)直接測序進行基因突變位點的檢測及鑒定。結(jié)果 在337名耳聾學生和150名健康人群中未檢測到GJB3基因C538T和G547A的突變。結(jié)論 GJB3基因C538T和G547A可能不是該地區(qū)非綜合征型耳聾患者的突變熱點，為進一步開展耳聾基因的篩查研究提供重要信息。

聾；GJB3基因；DNA；突變；測序

(ChinJLabDiagn,2016,20:2024)

耳聾(deafness)又名聽覺障礙(hearing impairment)或聽力喪失(hearing lossing)，是常見的感覺系統(tǒng)疾病之一。根據(jù)表型特點不同(是否伴隨其它疾病)，分為綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾。已有研究表明，約50-60%的耳聾患者有分子病因，為遺傳性聾，其中約80%的遺傳性聾患者為非綜合征型聾[1,2]。GJB3 (encoding connexin 31,Cx-31)基因突變可以引起常染色體顯性或者隱性非綜合征型耳聾。GJB3是夏家輝院士在世界上首次報道的耳聾相關(guān)基因，是我國克隆、定位疾病基因零的突破[3]。當前，北京解放軍總醫(yī)院等多個臨床和研究團隊在我國多個地區(qū)開展了耳聾患者GJB3基因突變的研究[4-6]，其中GJB3基因C538T和G547A位點被認為是致病突變，但其在云南地區(qū)非綜合征型耳聾人群中的攜帶率并不清楚。本研究以云南省部分特殊教育學校聾生為研究對象，通過PCR產(chǎn)物直接測序法來檢測337名聾生攜帶GJB3基因C538T和G547A突變的頻率，希望為明確該地區(qū)非綜合征型耳聾的分子病因、為開展耳聾基因臨床篩查及豐富中國人群致聾基因的突變類型和突變頻率提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 研究對象

實驗組為德宏州特教學校、騰沖特教學校、保山特教學校、麗江特教學校、普洱特教學校等職業(yè)學校的耳聾學生，對照組為聽力正常的人群。實驗組337名，包括男181例，女156例，平均年齡為14.31歲；對照組為150名，男79例，女71例，平均年齡為16.73歲.在知情同意后，采集1-2 ml外周靜脈血(EDTA抗凝)。

1.2 主要儀器設(shè)備和試劑

離心機(Hitachi,CR22G)；PCR儀(Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler)；電泳槽和電泳儀(BG-Power 600i)；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad ChemiDoc XRS)；低溫冰箱(RECVO公司，572L型)；電熱恒溫三用水箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠，HH-W21 600型)；測序儀為ABI 3730XL。全血DNA提取試劑盒和電泳所需試劑購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PCR擴增試劑(2x Taq PCR MasterMix)購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA的提取 依照試劑盒說明書逐步抽提DNA，取1 μl用于瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余保存于-80℃冰箱備用。

1.3.2 引物設(shè)計與合成[7]從Genebank下載GJB3基因序列(NT_004511)，采用GeneTool軟件設(shè)計引物，上游引物為F:5-TACGATGGTTTTTCCTCTAATTCT-3’；下游引物為5-TTGCATAACTTAGTGAACTCAGAG -3，擴增片段為986 bp。

1.3.3 GJB3 DNA基因片段的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR) PCR擴增體系為20 μl，含2 xTaq PCR MasterMix 10 μl，25 μmol/L上游、下游引物各0.25 μl，模板DNA 1 μl,擴增條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，53℃退火45 s,72℃延伸60 s,32個循環(huán)；72 ℃充分延伸7 min，4℃保存。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 取1 μl PCR擴增產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.3.5 PCR產(chǎn)物直接測序 測序引物與PCR擴增引物相同,對PCR產(chǎn)物用酒精沉淀法純化，經(jīng)Bigdye測序反應(yīng)，用ABI 3730XL測序儀進行測序.測序結(jié)果采用Genetool軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 GJB3 DNA基因片段的PCR擴增產(chǎn)物

對337名耳聾學生和150例健康人的外周血DNA樣本進行PCR擴增，均擴增到特異性條帶986 bp，其片段大小與預(yù)期結(jié)果相符合(見圖1)。

圖1 含GJB3基因C538T和G547A位點的PCR擴增產(chǎn)物

2.2 GJB3 DNA基因片段擴增產(chǎn)物的測序分析

將全部樣本的PCR擴增產(chǎn)物直接測序，將其與GJB3基因的標準序列(NG_008309.1；GI:194595505)比對，在耳聾組和對照組中的所有個體均未檢測到GJB3基因C538T和G547A位點的突變。

3 討論

GJB3基因定位于染色體1p33-p35，全長3617 bp，編碼有270個氨基酸的縫隙連接蛋白Cx31[8]?？p隙連接(gap junction)又稱為通訊連接(communication junction)，見于相鄰兩細胞的胞膜中，其形態(tài)為許多間隔大致相等、彼此相接的連接點，中間有直徑約2 nm的管腔，使細胞間可以直接交換某些小分子物質(zhì)和離子，借以傳遞化學信號和電沖動[9]。內(nèi)耳的縫隙連接在維持內(nèi)淋巴液K+離子濃度、正常聽覺系統(tǒng)的功能中扮演重要角色[10]。

GJB3基因在DNA水平的突變可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后翻譯出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的異常。據(jù)夏家輝院士等報道，在1個湖南耳聾家系中檢測到GJB3基因編碼區(qū)C538T突變，使其參與編碼的第180位氨基酸出現(xiàn)終止突變；其次，在1個浙江耳聾家系中檢測到GJB3基因編碼區(qū)G547A突變，使183位氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼幔涣硗?，該研究團隊對GJB3基因C538T和G547A突變的功能、機制研究的結(jié)果表明，GJB3基因突變與耳聾表型相關(guān)，是致聾的分子病因[3]。李慶中等對130例非綜合征型遺傳性耳聾患者檢測GJB3基因編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性，僅有1名患者攜帶GJB3基因G547A雜合突變，未檢測到C538T位點的突變[6]。陳塏鈿等在200名非綜合征型聾患者中沒有檢測到GJB3基因C538T和G547A突變[11]。Mhatre等用PCR產(chǎn)物測序法、高效液相檢測63個非綜合征型耳聾患者攜帶的GJB3基因多態(tài)性位點，未檢測到GJB3基因C538T和G547A突變[12]。馬靜等在昆明市兒童醫(yī)院門診收集到的118例極重度非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患兒外周血樣本，抽提DNA后用飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測GJB3基因C538T和G547A突變，在所有個體中均未發(fā)現(xiàn)該2個位點的突變[13]。上述研究結(jié)果與我們用PCR產(chǎn)物直接測序法檢測云南部分地區(qū)特教學校的337名非綜合征性耳聾患者的結(jié)果基本一致。提示GJB3基因C538T和G547A可能不是云南地區(qū)散發(fā)的非綜合征性耳聾患者的突變熱點。

綜上所述，GJB3基因C538T和G547A突變在散發(fā)性非綜合征型耳聾患者中攜帶率較低，其可能是部分耳聾家系的分子病因。已有的研究表明，致聾基因數(shù)目龐大，而我們當今認識到的僅是有限的一部分，對于分子病因尚不清楚的患者可能存在其它基因、其它位點的突變[14]。由此可見，對遺傳性耳聾患者分子病因的探討及其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用還有很遠的路要走。

致謝：感謝德宏州特教學校、怒江特教學校、普洱特教學校等所有教職員工和學生在本課題研究中給予的支持和幫助。

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Mutation analysis of GJB3 538T and G547A in deafness students from Yunnan special educational schools

LIYan-qiong,LIUDe-sheng,LüChao-shao,etal.

(InstituteofClinicalandBasicMedicalSciences,TheAffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology(YunnanProvincialFirstPeople’sHospital),YunnanProvincialKeyLaboratoryforBirthDefectsandGeneticDiseases,Kunming650032，China)

Objective Objective To explore the gene mutations of GJB3 C538T and G547A in Yunnan special educational schools with non-syndromic hearing impairment students.Methods Genomic DNA was isolated from peripheral blood of 337 students with hearing impairment and 150 healthy controls.The polymerase chain reaction (PCR) was performed with one pair of primer in the subjec’s DNA fragments of GJB3,and subsequently its products was analyzed by direct sequencing to identify mutations spots including GJB3 C538T and G547A.Results There were no mutation of GJB3 C538T and G547A in deafness students with non-syndromic hearing impairment as well as in the control group.Conclusion It may imply that GJB3 C538T and G547A were not mutation spots in the area of Yunnan province.The results provide important information for development gene screening in the deafness patients.

Deafness;GJB3 gene;DNA;mutation;sequencing

國家自然科學基金資助項目(31060155)，云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學聯(lián)合專項應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2014FB092)

1007-4287(2016)12-2024-03

R764.43

A

2016-08-10)

*通訊作者