蛋白激酶SGK3過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖和侵襲

鄒祥南，張國揚，劉忠豪，杜雪峰，郭紅艷，孫曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1.12級檢驗專業(yè)；2.14級口腔專業(yè)；3.14級影像專業(yè)；4.生物化學(xué)教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蛋白激酶SGK3過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖和侵襲

鄒祥南1，張國揚2，劉忠豪3，杜雪峰1，郭紅艷4*，孫曉杰4*

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1.12級檢驗專業(yè)；2.14級口腔專業(yè)；3.14級影像專業(yè)；4.生物化學(xué)教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 研究血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶3(SGK3)過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞克隆增殖和侵襲行為的影響及其機(jī)制。方法 免疫組化方法檢測不同類型乳腺癌組織中SGK3蛋白的表達(dá)；通過GenEscortTMⅠ介導(dǎo)用重組質(zhì)粒pEGFPN1-SGK3瞬時轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，免疫印跡方法對轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的蛋白表達(dá)進(jìn)行鑒定；克隆形成實驗觀察SGK3過表達(dá)對單個細(xì)胞克隆增殖的影響；細(xì)胞侵襲實驗觀察細(xì)胞侵襲能力的變化；免疫印跡方法檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果 SGK3在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織和乳腺纖維腺瘤組織(P<0.05)。過表達(dá)SGK3的MDA-MB-231細(xì)胞，其克隆形成和侵襲力均增強(qiáng)，與對照組細(xì)胞相比，均有顯著性差異(P<0.01)。SGK3過表達(dá)不影響乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1(BRMS1)的表達(dá)，但卻使MMP2和MMP9的表達(dá)明顯升高。結(jié)論 SGK3在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中呈高表達(dá)，SGK3過表達(dá)可通過上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2和MMP9的表達(dá)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲。

SGK3；乳腺癌；侵襲；MMP2；MMP9

(ChinJLabDiagn,2016,20:1990)

血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶3(SGK3)是近年來新發(fā)現(xiàn)的PI3K下游信號分子，其與人類乳腺癌、肝癌、大腸癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[1-4]。由于SGK3在結(jié)構(gòu)上與PI3K 的下游分子Akt/PKB高度同源，且二者具有相似的上游和下游靶點，因此推測SGK3很可能和Akt/PKB具有相似的細(xì)胞內(nèi)功能。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，SGK3在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡[5]。本文在此基礎(chǔ)上，利用組織芯片技術(shù)檢測SGK3在不同類型乳腺癌中的表達(dá)，并在細(xì)胞水平觀察SGK3過表達(dá)對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-MB-231侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響，為闡明SGK3的功能以及靶向PI3K/SGK3的抗腫瘤藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織芯片、質(zhì)粒和細(xì)胞株 乳腺癌組織芯片BR1503d購自西安艾麗娜生物科技有限公司；重組質(zhì)粒pEGFPN1-SKG3含有人SGK3 cDNA基因，由本室郭紅艷博士構(gòu)建[6]，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增后用于本實驗研究。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-MB-231由本室凍存，細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑和抗體 RPMI1640和G418為GibcoBRL公司產(chǎn)品 新生小牛血清、胰酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板為丹麥Nunc公司產(chǎn)品；Transwell培養(yǎng)板為美國Costar公司產(chǎn)品；GFP、MMP2、MMP9、BRMS1以及β-actin抗體為CST公司產(chǎn)品；HRP-IgG和ECL發(fā)光試劑盒為Santa Cruz公司產(chǎn)品；UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒(鼠/兔)、DAB顯色試劑盒為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品；DEL2000蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)晶紫為鼎國生物公司產(chǎn)品；垂直板電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)MINI型、GEL Doc 2000數(shù)字成像系統(tǒng)為美國BioRad公司產(chǎn)品。

1.3 主要方法

1.3.1 免疫組化 乳腺癌組織芯片(BR1503d)為組織微陣列芯片，含正常乳腺組織及乳腺纖維腺瘤各3例、浸潤性導(dǎo)管癌60例，芯片樣本取自臨床19-74歲女性病例，免疫組化方法進(jìn)行檢測，光鏡下呈棕黃色判定為SGK3表達(dá)陽性，用Imagepro-PLus軟件測定IOD值，分析SGK3的表達(dá)情況。

1.3.2 基因轉(zhuǎn)染 采用GenEscortTMⅠ介導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，具體操作按說明書進(jìn)行。將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種到6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞總面積達(dá)到60-80%，取pEGFPN1和pEGFPN1-SGK3質(zhì)粒各3 μg進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別命名為231/pEGFPN1和231/ pEGFPN1-SGK3，48小時后提取細(xì)胞總蛋白，用抗GFP抗體對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白表達(dá)進(jìn)行鑒定。

1.3.3 克隆形成實驗 將MDA-MB-231、231/pEGFPN1和231/ pEGFPN1-SGK3細(xì)胞按103個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個平行孔，每周換液2-3次，2周后觀察克隆形成情況。經(jīng)甲醇固定、0.4%結(jié)晶紫染色后，計數(shù)克隆數(shù)，并以形成的克隆數(shù)除以接種細(xì)胞數(shù)，計算克隆形成率。

1.3.4 細(xì)胞侵襲實驗 細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h，0.25%胰酶消化細(xì)胞，PBS洗2遍，用含0.2%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/ml，取細(xì)胞懸液200 μl加入基質(zhì)膠包被好的Transwell侵襲小杯，每組3個復(fù)孔，孔板下室加入600 μl含10%血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出Transwell侵襲小杯，PBS沖洗后用棉簽輕輕擦掉杯底膜上層的未遷移細(xì)胞，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗，顯微鏡下隨機(jī)觀察5個視野記數(shù)并拍照。

1.3.5 免疫印跡實驗 提取各組細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜。封閉液中室溫封閉2 h；按1∶500-1∶1000分別稀釋一抗MMP2、MMP9、GFP 、BRMS1以及β-Actin，4℃過夜；TTBS漂洗3次，每次10 min；再按1：1000稀釋二抗，室溫孵育1 h；用TTBS室溫漂洗后進(jìn)行ECL顯色。利用GEL Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)及其圖像分析軟件Multi-AnalystR/PC對Western Blot雜交帶進(jìn)行密度掃描分析。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，采用LSD、Dunnett T3方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白激酶SGK3在不同類型乳腺癌組織中的表達(dá)

免疫組化實驗結(jié)果如圖1所示，SGK3在乳腺癌癌旁組織、乳腺纖維腺瘤以及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中均有表達(dá)，但在癌旁組織(IOD=199.95±52.92)和乳腺纖維腺瘤(IOD=160.48±48.45)中的表達(dá)量無明顯差異，而在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)卻明顯增高(IOD=338.15±133.35)，與前兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 融合蛋白SGK3-GFP表達(dá)的鑒定

轉(zhuǎn)染48 h后，提取兩組細(xì)胞總蛋白，用抗GFP抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果在兩組細(xì)胞中均檢測到蛋白帶(圖2A)，其中轉(zhuǎn)染空載體組表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，而轉(zhuǎn)染pGFPN1-SGK3組細(xì)胞表達(dá)融合蛋白SGK3-GFP，但兩組細(xì)胞的蛋白表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，見圖2B。

2.3 SGK3過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的克隆形成

克隆形成實驗結(jié)果顯示，在形成的克隆大小上三組細(xì)胞之間無明顯差異，但在克隆形成的數(shù)量上231/pEGFPN1-SGK3組明顯高于其他兩組。計算各組細(xì)胞的克隆形成率，結(jié)果MDA-MB-231和231/pEGFPN1組分別為15.8%±2.1%和16.9%±3.7%，而231/pEGFPN1-SGK3組為23.9%±4.3%，與前兩組細(xì)胞相比均有顯著性差異(P<0.01)，表明SGK3的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的克隆增殖能力，見圖3。

圖1 免疫組化方法檢測乳腺癌組織中SGK3蛋白的表達(dá) (40×)

圖2 免疫印跡方法鑒定MDA-MB-231細(xì)胞中融合蛋白SGK3-GFP的表達(dá)

圖3 SGK3過表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.4 SGK3過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲

在Transwell侵襲實驗24 h后，親本細(xì)胞和空載體細(xì)胞組僅有少量細(xì)胞穿過，但過表達(dá)SGK3的MDA-MB-231細(xì)胞組可見大量細(xì)胞穿過，細(xì)胞計數(shù)結(jié)果MDA-MB-231、231/pEGFPN1以及231/pEGFPN1-SGK3組穿過的細(xì)胞數(shù)分別為55.4±9.68、60.6±10.92和115±16.71，與前兩組相比，有顯著性差異(P<0.05)，表明SGK3過表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞通過基質(zhì)膠的侵襲行為(圖4)。

圖4 細(xì)胞侵襲實驗檢測各組細(xì)胞的侵襲能力

2.5 SGK3過表達(dá)對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的影響

免疫印跡實驗在各組細(xì)胞中均檢測到MMP2、MMP9以及BRMS1蛋白的表達(dá)，但各組細(xì)胞之間BRMS1的表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，而231/pEGFP-SGK3組MMP2和MMP9的表達(dá)量卻明顯高于其它兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 免疫印跡技術(shù)檢測各組細(xì)胞中MMP2、MMP9和BRMS1的表達(dá)

3 討論

SGK3屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在哺乳動物組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，通過磷酸化下游的靶蛋白而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、遷移以及物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運等[7-9]，與人類多種疾病包括腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)SGK3在正常乳腺組織、良性乳腺腫瘤以及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中均有表達(dá)，但其在浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)明顯高于前兩者，由此我們推測，SGK3的異常表達(dá)很可能與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)。為了探討SGK3與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，我們利用乳腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-MB-231為實驗材料，觀察SGK3過表達(dá)對細(xì)胞克隆增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響。結(jié)果顯示，高表達(dá)SGK3的細(xì)胞其單個細(xì)胞的克隆增殖能力以及細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的侵襲能力均明顯高于對照組，由于腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解是侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，因此本研究結(jié)果表明SGK3能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲行為。

作為乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子，BRMS1高表達(dá)不僅能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[10]，而且還能通過Stat3信號途徑參與非小細(xì)胞肺癌凋亡和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[11]。但本研究發(fā)現(xiàn)，SGK3的高表達(dá)不影響乳腺癌細(xì)胞內(nèi)源性BRMS1的表達(dá)。由于腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與其產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生降解細(xì)胞外基質(zhì)或基底膜的蛋白酶有關(guān)，比如MMP2和MMP9在腫瘤轉(zhuǎn)移區(qū)域的表達(dá)明顯高于原發(fā)區(qū)域[12]，而且MMP2/MMP9可經(jīng)由PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[13]。本研究證實，高表達(dá)SGK3的MDA-MB-231細(xì)胞其內(nèi)源性MMP-2 和 MMP-9 的表達(dá)均明顯升高，推測SGK3可通過調(diào)控MMP2/MMP9的表達(dá)而影響MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲行為。

雌激素受體(estrogen receptor,ER)的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病預(yù)后以及患者生存期密切相關(guān)，ER+的乳腺腫瘤中SGK3的表達(dá)水平與患者的生存和預(yù)后呈正相關(guān)[14,15]，但迄今為止未發(fā)現(xiàn)Akt的表達(dá)與腫瘤預(yù)后的相關(guān)性。已知MDA-MB-231為ER-的乳腺癌細(xì)胞[16]，本研究發(fā)現(xiàn)SGK3過表達(dá)能夠促進(jìn)該細(xì)胞的克隆增殖和侵襲行為，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)SGK3促進(jìn)ER+的乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移[17]，表明SGK3對乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲均有影響與ER受體的表達(dá)與否可能無關(guān)。但有關(guān)SGK3與ER-的乳腺癌患者生存和預(yù)后的相關(guān)性研究還需要大量的臨床病例資料分析，這也是我們下一步研究的方向。

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Overexpression of protein kinase SGK3 promotes proliferation and invasion of breast cancer cell line MDA-MB-231

ZOUXiang-nan，ZHANGGuo-yang,LIUZhong-hao，etal.

(QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,China)

Objective To study the effect of serum and glucocorticoid induced protein kinase 3 (SGK3) overexpression on the proliferation and invasion of breast cancer cells.Methods To detect the expression of SGK3 protein in different types of breast cancer tissues by immunohistochemistry.Transient transfection of MDA-MB-231 cells with pEGFPN1-SGK3 plasmid mediated by GenEscortTMⅠ.The expression of SGK3 in transfected cells was identified by Western blotting.The effect of SGK3 over expression on cell clonal proliferation was observed by colony formation assay.The changes of cell invasion ability were observed by Transwell invasion assay.The expression of tumor metastasis related genes was detected by Western blotting.Results The expression of SGK3 in breast invasive ductal carcinoma was significantly higher than that in normal breast tissues and breast fibroadenoma(P<0.05).The colony formation and the invasion ability were increased in SGK3 overexpression MDA-MB-231cells(P<0.01).Overexpression of SGK3 increased the expression of MMP2 and MMP9 but not effected the expression of breast cancer metastasis suppressor 1 (BRMS1) in MDA-MB-231 cells by Western blotting.Conclusion SGK3 was highly expressed in breast invasive ductal carcinoma tissues,overexpression of SGK3 promote invasion of breast cancer cells in vitro by increasing the expression of tumor metastasis related genes MMP2 and MMP9.

SGK3;breast cancer;invasion;MMP2;MMP9

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201511230010)

1007-4287(2016)12-1990-05

R737.9;R34

A

2016-05-18)

*通訊作者