豬圓環(huán)病毒病PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

師麗剛

（河南省洛陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 洛陽 471002）

豬圓環(huán)病毒病PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

師麗剛

（河南省洛陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 洛陽 471002）

根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）基因（Rep基因）保守序列設(shè)計(jì)1對引物P1和P2，擴(kuò)增700 bp的目的片段，該方法對豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒均成陰性，但可以特異地檢測出PCV2；本法能檢測出1.80 ng/μL圓環(huán)病毒的DNA。對擴(kuò)增目的片段測序，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段屬于PCV2。應(yīng)用本方法對14份臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，陽性樣本為6份。本研究結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的PCR方法檢測PCV2具有較好的敏感性和特異性，可用于PCV2感染疑似病例的診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。

豬圓環(huán)病毒2型；PCR；檢測

豬圓環(huán)病毒2型屬于圓環(huán)病毒屬，是已知最小的動(dòng)物病毒，PCV2基因組全長1 7681 768 bp[1]。PCV2的宿主主要是豬，各種年齡階段的豬均可以感染，而仔豬發(fā)病較嚴(yán)重，6～12周比較常見。1998年由于斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征作為新的疾病出現(xiàn)而發(fā)現(xiàn)了PCV2[2-3]，加拿大早在1990年已經(jīng)發(fā)生這種疾病。早在1962年就已用PCR檢測該病毒，PCV2疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)在1985年已開始在豬群中執(zhí)行[4]。中國在2000年第一次報(bào)道本病，而郎洪武等搜集了來自北京、河北等7個(gè)省市22個(gè)豬場的559份血清，并用ELISA方法檢測陽性率高達(dá)42.9%，而且斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）抗體陽性隨著豬的年齡增長而升高。目前，本病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，死亡率10%～30%不等[5]。

分析全球的不同PCV2的序列，核酸序列的一致性高達(dá)93%以上[6]。根據(jù)3.5%核酸序列的不同PCV2的序列，將PCV2分為PCV2a和PCV2b基因亞型[7]。在1980年來自Denmark報(bào)道了第三個(gè)基因亞型，命名為PCV2d[8]，還有一些數(shù)據(jù)表明存在第五個(gè)基因亞型[9]。PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、增生性壞死性肺炎等多種疾病[10]，其中以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征最常見。由PCV2引起的疾病嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，PCV2感染廣泛存在國內(nèi)外豬群中，而且由于PCV2感染及與其他病原體感染造成臨床癥狀和病理變化的多樣性和復(fù)雜性，給PCV2感染的臨床診斷增加了難度[11]。目前PCV2的傳統(tǒng)檢測方法有病毒分離免疫熒光試驗(yàn)、免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等[12]。費(fèi)時(shí)長、檢測靈敏度較低、準(zhǔn)確性差、成本高、特異性低是這些方法共有的缺點(diǎn)，尤其不能檢測亞臨床感染的豬，嚴(yán)重制約著豬業(yè)的發(fā)展。而分子生物學(xué)檢測方法則以檢測速度快、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)迅速占領(lǐng)市場，具有良好的前景。因此，建立一種既敏感又特異的檢測PCV2的方法顯得尤為重要，該方法的建立將有助于進(jìn)行PCV2病毒的檢測。由于目前對圓環(huán)病毒引起的相關(guān)疾病尚無有效的治療措施，而該方法可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)亞臨床癥狀的豬，以便對疾病的控制。

1.1病毒感染豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、副豬嗜血桿菌（HP）、豬偽狂犬病毒（PRV）均由洛陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室分離、鑒別并保存。

1.2主要試劑和主要儀器設(shè)備主要試劑：Ex Taq（5 U/μL）購自TaKaRa公司，2×Taq Mix Master（含染料）購自上海萊楓科技有限公司，病毒基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司，引物由上海生物工程有限公司合成，DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司，4 s Red Plus Nucleic Acid stain購自TaKaRa公司，瓊脂糖購自BIOWEST公司。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中PCV（2登錄號(hào)為EF524532 PCV2）設(shè)計(jì)引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列：上游引物P1：5、-TTGCTGAGCCTAGCGACACC-3、，下游引物P2：5、-TCGATCACACAGTCTCAGTAG-3、。預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段為700 bp。

1.4病毒基因組DDNNAA的提取按照病毒基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行操作，提取的DNA保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5PPCCRR反應(yīng)

1.5.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR反應(yīng)在50 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，引物Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，DNA模板各1 μL，Mix 25 μL，

1 材料與方法

H2O 22 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳測定，觀察結(jié)果。

1.5.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.5.2.1 最適模板用量的確立 分別取0.5、0.8、1、2、3、4、5、6 μL DNA模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，以確定最適的模板用量。

1.5.2.2 最適引物用量的確立 分別取不同用量的引物在50 μL的反應(yīng)體系中，上、下游引物各加入0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以確定最適的引物用量。

1.5.2.3 最適退火溫度的確立 分別設(shè)51、53、55、57、59℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以確定最適的退火溫度。

1.6PCR特異性試驗(yàn)以陽性病料提取PCV2的DNA、PPV、HP和PRV疫苗株中提取DNA，用已建立好的方法進(jìn)行擴(kuò)增，與其他疾病比較，來驗(yàn)證該方法的特異性。

1.7PCR敏感性試驗(yàn)將提取的DNA用蛋白質(zhì)核酸測定儀測定核酸濃度為180 ng/μL，將DNA進(jìn)行10倍系列稀釋1～8孔。

1.8臨床應(yīng)用用建立優(yōu)化的PCR檢測方法，對臨床送檢的14份疑似病料先提取DNA，對PCR陽性可增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入到1%瓊脂糖凝膠電泳中，電泳結(jié)果顯示該P(yáng)CR體系可以擴(kuò)增出一條約為700 bp的豬圓環(huán)病毒2型的基因片段（圖1），與預(yù)期大小相符合。

2.2特異性試驗(yàn)結(jié)果利用設(shè)計(jì)的引物對豬圓環(huán)病毒2型擴(kuò)增出了700 bp的目的基因片段，而PPV、CSFV和PRV均未擴(kuò)增出目的片段（圖2）。

2.3敏感性試驗(yàn)結(jié)果將模板DNA經(jīng)10倍系列稀釋后分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在濃度180×10-2ng/μL時(shí)仍出現(xiàn)目的片段，而在濃度180×10-3ng/μL時(shí)不出現(xiàn)目的片段，可檢測出濃度1.80 ng/μL的模板，結(jié)果見圖3。

2.4臨床應(yīng)用應(yīng)用本方法建立的豬圓環(huán)病毒2型PCR方法檢測了14份在不同地方采集的豬組織病料。結(jié)果顯示陽性樣品6份（圖4），將陽性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠、純化、克隆、測序，證明是豬圓環(huán)病毒2型。同時(shí)應(yīng)用市場現(xiàn)有試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，符合率為100%。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products

圖2 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The specific test results of PCR

3 討論與結(jié)論

PCV2感染不僅可引起豬皮炎腎病綜合征（porcine dermatitis andnephropathy syndrome，PDNS）、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（post-weaning multisystem wasting syndrome，PMWS）、增生性壞死性肺炎（porcine proliferative and necrotizing pneumonia，PNP）、豬繁殖與呼吸綜合征以及仔豬傳染性先天震顫等多種疾病，而且PCV2感染機(jī)體后侵害宿主免疫系統(tǒng)，并引起病豬免疫抑制，所以更易與其他病原發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染，進(jìn)一步加劇了當(dāng)前豬病的復(fù)雜性，包括其他病毒、細(xì)菌、寄生蟲及其他重大動(dòng)物傳染病[13-14]。而且引起疫苗效力的下降，給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，為了給養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展提供重要保障，必須防止豬群中的PCV2感染。目前針對PCV2的血清學(xué)技術(shù)大多數(shù)都是檢測PCV2抗體的總量，不能決定抗體中和能力。試驗(yàn)表明即便在PCV2抗體高滴度情況下，PCV2也能持續(xù)存在于組織中[15-18]。因此，為了給PCV2相關(guān)疾病的防控提供技術(shù)保障，減少由于PCV2對豬場造成的經(jīng)濟(jì)損失，有必要建立一種更加有效且方便的的PCV2檢測方法。血清學(xué)試驗(yàn)只能檢測抗體而無法判斷是否存在PCV2，而本研究這可以很好的避免血清學(xué)存在的弊端。然而，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)更應(yīng)該結(jié)合組織病變、臨床癥狀和流行病學(xué)等輔助手段進(jìn)行綜合診斷，盡可能地避免本研究建立的PCR方法出現(xiàn)假陽性結(jié)果的情況。相對于目前我國常用的免疫熒光試驗(yàn)和免疫組化法以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法，而快速、敏感、準(zhǔn)確、特異性高等是PCR檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。但是，很多試驗(yàn)因素影響著PCR檢測方法，比如，DNA的純度及電泳時(shí)的用量、引物的特異性、退火的溫度、病料的采取及保存等都會(huì)影響試驗(yàn)的結(jié)果。但最重要的還是試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)引物的敏感性和特異性，快速有效地檢測必須要有較高敏感性和特異性的引物。所以本研究首先針對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，以保證整個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)確高效進(jìn)行，減低非特異性反應(yīng)，提高整個(gè)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和敏感性。

圖3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensitivity test results of PCR

圖4 臨床樣品的檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of Clinical samples

本研究通過優(yōu)化建立的PCR檢測方法，僅對于PCV2可以擴(kuò)增700 bp的目的片段，而其他中的病毒無法擴(kuò)增出目的片段，因此可以說明選取的病料、DNA的提取、設(shè)計(jì)的引物、PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件、瓊脂糖凝膠電泳優(yōu)化參數(shù)均合理；本方法對PPV、CSFV、PRV的檢測結(jié)果均為陰性，只對PCV2能擴(kuò)增出700 bp的特異性片段，故可以說明其具有良好的特異性；同時(shí)建立的PCR檢測方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性好。該研究操作時(shí)間短，試驗(yàn)程序較為簡便、容易操作而且價(jià)格低廉，為PCV2的診斷和流行病學(xué)的研究提供了一種簡便而且有效的實(shí)驗(yàn)室檢測方法。

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Development of PCR to Detect Porcine circovirus Type2 and its clinical Application

Shi Ligang
(Animal disease prevention and control center of Luoyang,Henan Luoyang 471002)

Porcine circovirus type 2(PCV2)is one of the most important pathogens in swine,a PCR method was established by using a set of primers derived from the published nucleotide sequence of the PCV2genes(Rep)in GenBank.In order to confirm its specificity,the PCR was implemented by using the template DNA,and the expected products of 700 bp were only detected in PCV2, however no specific band was detected in other virus such as PPV,CSFV,PRV.The lowest DNA consistence which could be detected by the PCR method was 1.80 ng/μL.In order to further investigate the prevalence of PCV2,14 clinic samples were detected.The data indicated that PCV2in 6 samples were positive.The experiments indicate the PCR method could be used in diagnosis and epidemiology investigating.

Porcine circovirus type 2;PCR;Detection

S858.28 < class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

B

1672-9692(2016)08-0001-05

2016-06-19

師麗剛（1980-），男，山西省長治人，獸醫(yī)師，畢業(yè)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)專業(yè)，主要從事獸醫(yī)臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷工作。