HuN4-F112株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗免疫后病毒血癥和抗體消長(zhǎng)規(guī)律的試驗(yàn)報(bào)告

曹明慧

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

HuN4-F112株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗免疫后病毒血癥和抗體消長(zhǎng)規(guī)律的試驗(yàn)報(bào)告

曹明慧

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

應(yīng)用高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗（HuN4-F112株）對(duì)28～30日齡的仔豬進(jìn)行免疫，并定期采樣檢測(cè)，研究免疫后病毒血癥持續(xù)時(shí)間和抗體消長(zhǎng)規(guī)律，結(jié)果表明，病毒血癥在免疫后第1周即可出現(xiàn)，最長(zhǎng)可持續(xù)至免疫后第6周；疫苗免疫后，母源抗體明顯下降，免疫后第3周平均阻斷率最低為18%，此后開始上升，至免疫后第7周平均阻斷率達(dá)到最高值85%，隨后開始緩慢下降，至免疫后第16周時(shí)為54%。研究表明，HuN4-F112株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫后病毒血癥持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)為6周，抗體水平在免疫后第7周時(shí)達(dá)到最高。

仔豬；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗（HuN4-F112株）；免疫；消長(zhǎng)規(guī)律

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus）變異株引起的一種急性高致死性疫病[1]。發(fā)病主要特征為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、木乃伊胎等，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上；仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀，感染率可達(dá)100%，死亡率在50%以上[2-3]。目前，我國(guó)使用的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均為活疫苗，據(jù)報(bào)道活疫苗免疫后可在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制并持續(xù)存在。為掌握高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后在豬體內(nèi)的存在時(shí)間和抗體的消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行了本試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 試驗(yàn)豬 在某豬場(chǎng)選擇28～30日齡、未進(jìn)行高致病性豬繁殖與呼吸綜合征免疫的健康仔豬15頭，經(jīng)熒光RT-PCR檢測(cè)，豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、2型圓環(huán)病毒、豬偽狂犬均為陰性，試驗(yàn)豬編號(hào)為A1～A15。

1.1.2 疫苗 湖南株（HuN4-F112株）高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，政府招標(biāo)采購(gòu)。

1.1.3 RT-PCR試劑 鑒別檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）高致病性強(qiáng)毒和致弱HuN4-F112株疫苗毒的RT-PCR引物，由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；dNTP、Primescript RT Enzyme mix、Oligo dT primer、Ex Taq聚合酶等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒 購(gòu)自北京天之泰生物科技有限公司，法國(guó)LSI公司生產(chǎn)。

1.1.5 核酸提取試劑 核酸提取試劑盒（磁珠法），購(gòu)自西安天隆生物科技有限公司。

1.1.6 試驗(yàn)器材 PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，核酸提取儀，伯樂iMark酶標(biāo)儀。

1.2方法

1.2.1 免疫注射 按疫苗說明書提供的免疫劑量和注射部位對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行免疫注射。

1.2.2 采血 試驗(yàn)豬在免疫前采血1次；免疫后每隔1周采血1次，連續(xù)采10周；以后每隔2周采血1次，連續(xù)采3次。分離血清，進(jìn)行高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒（HuN4-F112株）核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)。

1.2.3 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（HuN4-F112株）核酸檢測(cè)

1.2.3.1 核酸提取 在96孔核酸提取板的第1列及第7列孔中分別加入200 μL血清，10 μL Proteinase K，4 μL Acryl Carrier，然后將板放入核酸提取儀中，按說明書程序進(jìn)行自動(dòng)化提取。

1.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄 RNase-free dH2O 5 μL，5× Primescript buffer 2 μL，Primescript RT Enzyme mixⅠ0.5 μL，Oligo dT primer 0.5 μL，樣品RNA 2 μL?；靹?，37℃ 15 min，85℃ 5 s。1.2.3.3 PCR擴(kuò)增 10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）3 μL，引物1、引物2、引物3（10 pmol/ μL）各0.5 μL，Ex Taq聚合酶0.25 μL，cDNA 2 μL，dH2O 11.25 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃ 25 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.3.4 電泳 將PCR產(chǎn)物用濃度為1.5%的瓊脂糖以5 V/cm電壓進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察。擴(kuò)增出1條約480 bp的特異性條帶，則判為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗毒(HuN4-F112株）核酸陽(yáng)性；擴(kuò)增出2條特異性條帶（480 bp和340 bp）時(shí)，判為豬繁殖與呼吸綜合征野毒核酸陽(yáng)性。

1.2.4 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè) ①在ELISA板相應(yīng)孔中加入50 μL陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照及200倍稀釋的樣品；②蓋上膜，37℃作用60 min；③用300 μL洗液洗3遍，拍干；④每孔加入50 μL酶標(biāo)抗體；⑤蓋上膜，37℃作用60 min；⑥用300 μL洗液洗3遍，拍干；⑦加入50 μL底物，20～25℃作用10 min；⑧加入50 μL終止液，在450 nm下讀數(shù)并計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1HuN4-F112株疫苗核酸檢測(cè)結(jié)果免疫前疫苗毒核酸均為陰性。在免疫后1周時(shí)A2、A4、A5、A13號(hào)這4頭豬疫苗毒核酸為陽(yáng)性，免疫后2周時(shí)這4頭豬變?yōu)殛幮?，而A6、A11、A12、A15號(hào)這4頭豬的疫苗毒核酸為陽(yáng)性。免疫后3周時(shí)陽(yáng)性數(shù)最多，達(dá)到7頭，陽(yáng)性率為47%（7/15），其中有4頭豬（A4、A6、A11、A22）在免疫后1周或2周時(shí)疫苗核酸已經(jīng)為陽(yáng)性。到免疫后4周時(shí)有5頭陽(yáng)性，陽(yáng)性數(shù)開始下降，除A10號(hào)試驗(yàn)豬為首次檢出陽(yáng)性外，其余均為前期檢出過陽(yáng)性。至免疫后5周時(shí)沒有陽(yáng)性檢出，到免疫后第6周時(shí)A6號(hào)豬又為陽(yáng)性，從第7周開始再未檢出陽(yáng)性。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，A1、A3、A8號(hào)豬未檢測(cè)到疫苗毒核酸，見表1。

2.2豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)結(jié)果由于母源抗體的存在，免疫前抗體阻斷率平均為82%，免疫后抗體水平開始下降，免疫后1周時(shí)下降至30%，免疫后2周時(shí)降至19%，至免疫后第3周降至最低，為18%。此后開始緩慢上升，至第4周升至為28%，到免疫后第5周時(shí)上升至67%，一直升至免疫后第7周85%這一最高水平后開始緩慢下降，至免疫后第16周時(shí)為54%。

表1 血清中HuN4-F112株疫苗毒核酸檢測(cè)結(jié)果Table1 The NAT result of the HuN4-F112 strain in the experimental pigs serum

試驗(yàn)豬抗體的陽(yáng)性率在免疫前也很高，為93%。免疫后陽(yáng)性率開始下降，至免疫后第3周時(shí)陽(yáng)性率只有33%，隨后開始上升，至免疫后第5周時(shí)達(dá)到100%，此后一直在87%～100%之間，見表2。

2.3病毒血癥與抗體水平的比較分析比較試驗(yàn)豬的病毒血癥與平均抗體水平的變化規(guī)律可以發(fā)現(xiàn)，病毒血癥的嚴(yán)重程度與抗體水平的高低呈負(fù)相關(guān)，即抗體水平低時(shí)，病毒血癥就比較嚴(yán)重，隨著抗體水平的不斷上升，病毒血癥逐漸減弱，當(dāng)抗體維持在較高水平時(shí)，病毒血癥消失?；钜呙缑庖吆蟊蛔胸i體內(nèi)的母源抗體中和一部分，表現(xiàn)為母源抗體的迅速降低；剩余的疫苗刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的抗體又不斷的將活疫苗毒中和，表現(xiàn)為抗體一直處于較低水平；隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗體水平進(jìn)一步提高，疫苗毒不斷的被中和，以致無(wú)法被檢測(cè)到，表現(xiàn)為病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性[4]，見圖1。

3 討論與小結(jié)

PRRS流行病學(xué)非常復(fù)雜，豬繁殖與呼吸綜合征

病毒（PRRSV）感染后可引起長(zhǎng)期的持續(xù)性感染，豬場(chǎng)一旦污染該病毒后很難凈化[5]。目前，臨床上主要使用PRRSV滅活苗或弱毒苗進(jìn)行免疫預(yù)防，雖然對(duì)該病的控制取得了一定成效，但仍然存在較多的問題。滅活苗免疫接種后，抗PRRSV特異性抗體產(chǎn)生的滴度低、速度慢，只能提供部分免疫保護(hù)[6]。弱毒苗免疫效果較好，但接種豬只后，疫苗毒會(huì)在豬只體內(nèi)繁殖，并存在較長(zhǎng)時(shí)間。研究結(jié)果表明，HuN4-F112株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒在豬只免疫后1周即可從血清中檢測(cè)到，病毒血癥最長(zhǎng)可持續(xù)到免疫后第6周。

表2 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)結(jié)果Table2 The antibody testing results of PRRSV

圖1 病毒血癥陽(yáng)性率與平均抗體水平變化曲線Fig.1 The curves of viremia positive rate and average antibody levels

已經(jīng)證明中和抗體在預(yù)防PRRSV感染和病毒清除中扮演重要角色[7]，臨床上合理有效地利用疫苗來(lái)控制PRRS可以取得顯著效果，能夠減少病毒傳播及病理?yè)p傷，改善生產(chǎn)性能及降低發(fā)病率和死亡率等[8]。PRRS弱毒疫苗由于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的時(shí)間較長(zhǎng)兼具體液免疫和細(xì)胞免疫，具有較強(qiáng)的免疫優(yōu)勢(shì)而得到廣泛應(yīng)用。疫苗免疫后的抗體產(chǎn)生時(shí)間及持續(xù)時(shí)間、免疫方式和時(shí)機(jī)等是影響PRRS活疫苗免疫效果的主要因素。本研究通過對(duì)免疫HuN4-F112株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的豬群進(jìn)行抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)疫苗免疫后，仔豬的母源抗體會(huì)突然下降到較低水平，到免疫后第5周時(shí)免疫抗體才開始明顯上升，至第7周時(shí)達(dá)到最高，隨后開始緩慢下降。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有些豬抗體水平呈波浪式上升或下降，這可能與疫病狀況、生物安全水平、飼養(yǎng)管理水平等因素有關(guān)[9]。

目前，PRRS主要以持續(xù)性感染、亞臨床感染、免疫抑制和繼發(fā)細(xì)菌感染為流行特點(diǎn)，給臨床防控帶來(lái)困難。疫苗免疫作為防控PRRS的技術(shù)措施之一，不能完全清除病毒[10]。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)定期開展免疫抗體檢測(cè)，以此來(lái)判定疫苗的免疫效果，同時(shí)，也應(yīng)加強(qiáng)生物防范措施和飼養(yǎng)管理來(lái)防控該病。

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The testing report of viremia and antibody levels changing rule after immunizing high pathogenicity PRRS attenuated vaccine(HuN4-F112 strain)

Cao Minghui
(China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing 100081)

Immunize the piglets which were 28 to 30-days-old with the HuN4-F112 strain highly pathogenic PRRS(Porcine reproductive and respiratory syndrome)attenuated vaccine,observed the viremia duration and the changing rule of antibody levels after immunization through regular sampling detection.The results showed that,viremia can appear in the first week and be surviving for six weeks at most after immunization.After vaccine immunization,the maternal antibody declined significantly,the average blocking rate is maximum 85%in the seventh week,it began to decline slowly later,and the average blocking rate is 54%in the sixteenth week.This research shows that viremia can be surviving six weeks at most with HuN4-F112 strain highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome attenuated vaccine,and antibody levels can reach the peak in the seventh week.

Piglet;HuN4-F112 strain highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome attenuated vaccine;Immunize;Rule of growth and decline

S852.65+9< class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

B

1672-9692(2016)08-0037-05

2016-06-28

曹明慧（1991-），女，研究實(shí)習(xí)員，從事豬病研究工作。