熒光成像技術在組織熱損傷評價中的應用

湯陌生

麗水市人民醫(yī)院 醫(yī)學工程部，浙江麗水 323000

熒光成像技術在組織熱損傷評價中的應用

湯陌生

麗水市人民醫(yī)院 醫(yī)學工程部，浙江麗水 323000

目前組織熱損傷主要依靠離體切片組織學進行評價，尚沒有一種較理想的評價方法。本研究設計了一種利用340 nm波長的自體熒光成像技術評估活體組織熱損傷的方法，并采用該方法對激光照射后的牛腱組織進行了熒光成像，將熒光成像后的牛腱組織樣本與日光燈下成像后的牛腱組織樣本通過天狼星紅F3BA染色的組織學方法進行了驗證和比較。實驗結果顯示，樣本中受激光照射區(qū)域的膠原蛋白的自體熒光發(fā)生了明顯改變，說明該方法能夠用于評價組織熱損傷。

熒光成像技術；組織熱損傷；膠原蛋白

激光能夠對目標區(qū)域進行加熱，其原理是利用生物組織對光子的吸收特性，將光子能量轉變?yōu)闊崃浚贡徽丈浣M織溫度升高，導致組織中蛋白質脫水、變性、凝固或者消融[1]。目前，激光技術在醫(yī)學領域得到了越來越廣泛的應用，例如激光凝固[2]、激光血管清理重通[3]、激光組織焊接[4]等，其治療效果取決于向目標組織發(fā)送的激光能量和目標組織的特性，但激光治療也會導致組織熱損傷，而針對組織熱損傷的評價還停留在純經驗或半經驗狀態(tài)[5]。激光組織熱損傷評價涉及物理、生物、醫(yī)學等多學科知識，目前還沒有一個公認的數學評價模型[6]。為了在激光治療過程中更好地保護正常組織，需要開發(fā)一種快速、可靠的活體組織熱損傷評價方法。

自體熒光技術可分辨組織中的分子改變[7]，廣泛應用于生物組織改變的檢測[8]。針對自體熒光技術診斷腫瘤的相關研究表明，腫瘤組織的自體熒光改變多與組織中膠原蛋白的改變有關[9-11]。膠原蛋白在受熱后會發(fā)生變性，變性的膠原蛋白自體熒光光譜和熒光圖像會發(fā)生相應的變化[12]。而生物組織中存在著豐富的膠原蛋白，尤其是皮膚、肌腱、角膜等組織中的膠原蛋白含量更高[13-14]。因此，通過觀察熱損傷組織中膠原蛋白的自體熒光強度的改變，或可以對組織熱損傷進行評價。因此，本研究利用熱損傷組織中膠原蛋白自體熒光特性的改變，設計了一種使用自體熒光技術診斷活體組織熱損傷的方法，報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

熱損傷組織自體熒光成像裝置示意圖，見圖1(a)。其中，氙燈（300 W）為光源，光束通過340 nm的窄帶濾光片（半寬度為5 nm）。樣本與鏡頭平行，以避免不規(guī)則的折射對自體熒光圖像產生影響，經多功能光學測量計測量，到達樣本表面的光束能量為35 μW/cm2。在鏡頭1（105 mm UVNIKKOR鏡頭）前有一個380 nm的窄帶濾光片（半寬度為5 nm）。熒光經圖像增強器放大以后，由鏡頭2進行成像，最終由相機（TM-72EX，PULNIXAmerica Inc., Sunnyvale CA）采集熒光圖像并將其傳輸給電腦。圖像采集系統每秒可采集3幅圖像，為提高圖像質量，每幅熒光圖像為10幀圖像疊加所得。日光燈照射成像裝置示意圖，見圖1(b)。在相同條件下拍攝與熒光圖像同一位置的組織圖片。

圖1 實驗裝置示意圖

1.2 實驗方法

1.2.1 激發(fā)光和自體熒光波長的選擇

選取膠原蛋白粉作為本實驗的參考對象，膠原蛋白在325～355 nm光源激發(fā)下會產生熒光[15]。將膠原蛋白粉放在石英槽內，采集300～380 nm波長光激發(fā)下的膠原蛋白粉熒光光譜。根據膠原蛋白粉在不同波長激發(fā)光下的熒光光譜，本實驗選擇340 nm波長光作為激發(fā)光源，采集380 nm波長的熒光圖像。

1.2.2 熱損傷組織的自體熒光成像

（1）選擇含有豐富膠原蛋白的牛腱子肉作為實驗對象。將牛腱子肉切成厚度為5 mm的均勻薄片樣本，每6個樣本分為一組。

（2）然后采用氬氣激光誘導組織熱損傷，激光造成的熱損傷直徑約1 mm。激光到達樣本表面的功率密度為274 W/cm2，對樣本進行垂直照射，照射時間分別為3、6、9、12、15 s。

（3）將激光處理后的樣本放在石英載片上，進行熒光成像和日光燈下成像，并測量樣本組織表面熱損傷的直徑，測量結果采用均值加減標準差（±s）表示（表1）。完成測量后，將樣本在-20 ℃條件放置15 min，凍結后切割，在常溫下對樣本的橫截面進行熒光成像和日光燈下成像，并測量樣本的熱損傷垂直深度，測量結果采用均值加減標準差（±s）表示（表1）。

表1 不同照射時間下組織熱損傷深度（mm）

1.2.3 染色

在完成熒光分析和熒光成像后，對樣本進行脫水、石蠟處理，制成厚度為5 μm的切片。對切片采用天狼星紅F3BA進行染色，然后在偏振光顯微鏡下成像[16-17]。

2 結果

通過激光照射后的牛腱組織熒光圖像，見圖2～3?？梢钥闯?，由于組織中的膠原蛋白受激光照射變性，導致自體熒光圖像中熱損傷組織的熒光強度明顯變弱。熒光圖像中正常組織和熱損傷組織之間的界限清晰，與日光燈下的樣本圖像對比，能更容易的分辨正常組織和熱損傷組織。

圖2 激光照射后牛腱組織表面圖像

圖3 激光照射后牛腱組織橫截面圖像

通過測量樣本在不同照射時間下的自體熒光圖像和日光燈下的圖像中熱損傷部分的表面直徑（表1），可以看出當激光照射時間為3 s的時候，熒光圖像和日光燈下的圖像測量結果偏差較大。

對天狼星紅F3BA染色的同一樣本橫斷面的組織學切片分別在日光燈下成像和在偏振光下成像，發(fā)現激光照射后樣本組織結構消失，但正常組織和熱損傷組織的界限不明顯。偏振光下的圖像，見圖4，正常組織膠原纖維呈現黃色或橙色，受激光照射的組織則沒有這種雙折射光。分別測量同一樣本的自體熒光圖像、日光燈下的圖像和天狼星紅F3BA染色的偏振光照射圖像中的熱損傷深度（表1），發(fā)現偏振光照射下的圖像的測量結果和自體熒光圖像測量的結果基本一致。激光照射時間為3 s的樣本組測量數據顯示中，日光燈下成像和自體熒光成像所測得的熱損傷深度偏差較大。

圖4 F3BA染色切片圖

3 討論

查閱資料可知，膠原蛋白大約在65 ℃左右變性[18]，因此可以從組織學的角度評價組織熱損傷程度。在組織的自體熒光圖像中，激光照射區(qū)域的熒光強度明顯減弱。根據這一特性，筆者認為自體熒光成像技術可以作為一種定量技術來評價組織中膠原蛋白的改變。

本組研究中，表1中的數據證明了熒光圖像測得的結果和天狼星紅染色測定法的結果很接近，說明通過熒光成像檢測組織熱損傷比較可靠。通過圖2～4可以看出，在激光熱損傷組織中，最強大的熱損傷不是發(fā)生在樣本表面，而是發(fā)生在樣本的中心，這與文獻中的描述結果一致[19]。

日光燈下的圖像相當于肉眼看到的結果，從圖2～3可以看出，用肉眼來評價組織熱損傷不可靠、不精確。特別是在熱損傷不是很嚴重的情況下，通過肉眼辨別組織的激光熱損傷十分困難。

本研究結果表明，自體熒光成像技術可作為評價富含膠原蛋白的活體組織熱損傷的方法。這一技術能夠在激光治療過程中對治療效果做出有效、快速的評價，以避免正常組織受到不必要的損傷。

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Application of Fluorescence Imaging in the Evaluation of Thermal Damage to Tissue

TANG Mo-sheng
Department of Medical Engineering, People’s Hospital of Lishui City, Lishui Zhejiang 323000, China

Currently thermal tissue damage is mainly evaluated with histological examination which requires the removal of a section of tissue.There is no ideal method to detect molecular changes after thermal damage tissue. The research designed a new method to evaluate thermal tissue damagein situusing native fluorescence spectroscopic imaging under 340 nm excitation. Native fluorescence spectroscopic imaging was performed on laser irradiated bovine tendon tissue. The fluorescence imaging of the tendon tissue were confirmed and compared with the image of the laser-irradiated tendon tissue with the histological method of picrosirius red F3BA stain. The results of the experiment indicate that the changes in native fluorescence from collagen on the laser-irradiated tissue could be observed on the thermal damage region of the tissue.

fluorescence imaging; tissue thermal damage; collagen

R445.2

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.03.011

1674-1633(2016)03-0053-03

2015-11-04

2015-11-27

作者郵箱：tangmosheng@126.com