微孔板式微生物法快速檢測(cè)乳粉中維生素B12含量

姚春華，洪 敏，胡克岐

（浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

微孔板式微生物法快速檢測(cè)乳粉中維生素B12含量

姚春華，洪 敏，胡克岐

（浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

采用博歐實(shí)德和拜發(fā)2種品牌的微孔板式微生物法定量檢測(cè)試劑盒，測(cè)定市售嬰幼兒配方乳粉中維生素B12含量，并進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，在0.03～0.18μg·100g-1范圍內(nèi)，博歐實(shí)德和拜發(fā)2種品牌試劑盒檢測(cè)維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，檢測(cè)限為0.03μg·100g-1；重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.6%～8.6%和2.9%～4.4%，加標(biāo)回收率分別為82.5%～105.0%和90.2%～103.0%。2種品牌的試劑盒均能獲得較好效果，其中，拜發(fā)試劑盒重復(fù)性及準(zhǔn)確度更佳。相較于傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法，微孔板式微生物法具有方便、快捷等特點(diǎn)，為食品質(zhì)量控制工作提供一種耗時(shí)短、準(zhǔn)確性好、靈敏度高的手段。

乳粉；微生物法；微孔板試劑盒；維生素B12

維生素B12（Cyanocobalamin，VB12）又稱氰鈷胺素，是一組由鈷結(jié)合咕啉環(huán)的紅色類咕啉化合物的總稱［1］，是維持人體正常代謝和機(jī)能不可缺少的一種微量營(yíng)養(yǎng)素。人體每日所需的維生素B12為3μg左右，使用過(guò)量可引起過(guò)敏反應(yīng)，甚至過(guò)敏性休克。若缺乏維生素B12，將影響人體對(duì)葉酸的利用，還可導(dǎo)致周圍神經(jīng)炎和兒童貧血［2-3］。

目前，國(guó)內(nèi)維生素B12檢測(cè)方法主要有液相色譜法［1］、酶聯(lián)免疫法［4］和微生物法［5-10］，其中，微生物法是經(jīng)典的測(cè)定方法，它利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis）對(duì)維生素B12的特異性和靈敏性，定量測(cè)定試樣中維生素B12的含量，在測(cè)定的特異性、靈敏度和結(jié)果準(zhǔn)確性等方面是其他方法無(wú)法替代的。目前，我國(guó)現(xiàn)行的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.14—2010即是利用微生物法測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中維生素B12。但該方法操作過(guò)程繁瑣，且對(duì)菌株活力、測(cè)試培養(yǎng)基的優(yōu)劣、檢測(cè)所用器皿的清潔程度和試驗(yàn)人員操作有較高要求。本試驗(yàn)選用與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)原理相同的2種維生素B12測(cè)定試劑盒檢測(cè)嬰幼兒乳粉中維生素B12，通過(guò)對(duì)精密度、回收率等進(jìn)行比較，建立一種方便、快捷的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

VersaMax型酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司；BS224S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；580R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；JB-CJ-2FC型超凈工作臺(tái)，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；GRP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；微量移液器（20～200μL，100～1000μL），德國(guó)Eppendorf公司；H111191型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

微孔板形式的微生物法定量檢測(cè)維生素B12試劑盒，德國(guó)拜發(fā)IFP公司；Biostest維生素B12（氰鈷胺素）檢測(cè)試劑盒，北京博歐實(shí)德生物技術(shù)有限公司；維生素B12標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度為98.4%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；樣品為市售嬰幼兒乳粉。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取1 g均質(zhì)樣品至50 m L無(wú)菌離心管中，加入40 m L蒸餾水，搖勻。95℃水浴中提取30 m in，其間振蕩至少5次，同時(shí)確保離心管塞緊閉。水浴結(jié)束后迅速冷卻至30℃以下，12 000 g離心10 min。根據(jù)樣品維生素B12標(biāo)示濃度，取上清液在1.5 mL Eppendorf管中進(jìn)一步稀釋。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取出試劑盒中自帶的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品干粉，按照說(shuō)明書(shū)要求加入相應(yīng)體積的無(wú)菌水，充分搖勻后得到標(biāo)準(zhǔn)品原液。標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液稀釋方法：取6支1.5 m L Eppendorf管，編號(hào)分別為1、2、3、4、5、6，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品原液0、100、100、150、200、300μL，再分別加入無(wú)菌水900、900、400、350、300、200μL，制得終濃度分別為0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.18μg·100 g-1的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 測(cè)定培養(yǎng)基配制

取出試劑盒中維生素B12培養(yǎng)基，加入10 mL無(wú)菌水，蓋好培養(yǎng)基瓶，搖勻，95℃水浴5 min，其間振蕩至少2次，并確保瓶子密封。迅速冷卻至30℃以下，用0.2μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾至15 m L無(wú)菌離心管中。

1.2.4 樣品測(cè)定

取出需要數(shù)量的微孔板條在板上固定，移取150μL維生素B12培養(yǎng)基至微孔中，然后移取150μL標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋的樣品至微孔中，用黏合箔蓋住板條，于37℃黑暗條件下孵育48 h。孵育結(jié)束后，再次蓋緊黏合箔，將微孔板翻置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物均勻分布于培養(yǎng)基中，撕下黏合箔，清除微孔中液體表面的氣泡，用酶標(biāo)儀于630 nm讀取各微孔吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中維生素B12的含量。計(jì)算方法如下：

維生素B12（μg·100 g-1）=標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的VB12含量（μg）×稀釋倍數(shù)/樣品質(zhì)量（g）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以維生素B12含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。2種試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.03～0.18μg·100 g-1范圍內(nèi)線性均良好，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。檢測(cè)限可達(dá)到0.03μg·100 g-1。

圖1 博歐實(shí)德（A）和拜發(fā)（B）的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 重復(fù)性

選取4種不同品牌的奶粉，分別用2種試劑盒進(jìn)行6次試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1，2種試劑盒檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。博歐實(shí)德試劑盒和拜發(fā)試劑盒測(cè)定的4種不同奶粉維生素B12相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.6%～8.6%和2.9%～4.4%，拜發(fā)試劑盒的重復(fù)性相對(duì)較好。

2.3 加標(biāo)回收率

選取已知維生素B12含量的同一奶粉進(jìn)行3個(gè)梯度的加標(biāo)回收試驗(yàn)，博歐實(shí)德試劑盒和拜發(fā)試劑盒測(cè)定的奶粉樣品中維生素B12加標(biāo)回收率分別為82.5%～105.0%和90.2%～103.0%（表2），表明拜發(fā)試劑盒加標(biāo)回收率較歐博實(shí)德試劑盒有更高的平均回收率且具有更小的離散變化。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

運(yùn)用微生物法檢測(cè)維生素B12，其準(zhǔn)確度與靈敏度取決于實(shí)驗(yàn)中乳酸菌接種數(shù)量、菌活力、培養(yǎng)基、樣品處理方式以及人員操作等因素。商品化的試劑盒雖然根據(jù)其工藝水平可以在一定程度上減小各孔細(xì)菌活力、培養(yǎng)基等造成的誤差，但是操作過(guò)程中仍需嚴(yán)格無(wú)菌操作，所用移液槍槍頭、離心管、過(guò)濾器等需提前滅菌，以避免外來(lái)微生物的污染；同時(shí)需要選擇適宜的稀釋倍數(shù)，吸光度值不宜過(guò)低或過(guò)高。

商業(yè)化試劑盒可以簡(jiǎn)化操作步驟、縮短檢測(cè)所需的時(shí)間，為食品質(zhì)量控制工作提供一種耗時(shí)短、準(zhǔn)確性好、靈敏度高的手段。本研究分別采用博歐實(shí)德和拜發(fā)2種品牌的微孔板式試劑盒定量檢測(cè)市售嬰幼兒配方乳粉中維生素B12含量，這2種品牌試劑盒在0.03～0.18μg·100 g-1范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.992和0.996；檢測(cè)限為0.03μg·100 g-1；重復(fù)性試驗(yàn)中，樣品的平行性較好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.6%～8.6%和2.9%～4.4%，加標(biāo)回收率分別為82.5%～105.0%和90.2%～103.0%。2種品牌的試劑盒檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中維生素B12含量均能達(dá)到良好的效果，其中，拜發(fā)的試劑盒具有更好的重復(fù)性及準(zhǔn)確度。

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（責(zé)任編輯：侯春曉）

TS207.3

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：0528-9017（2016）12-2096-03

文獻(xiàn)著錄格式：姚春華，洪敏，胡克岐.微孔板式微生物法快速檢測(cè)乳粉中維生素B12含量［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（12）：2096-2098.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161255

2016-08-09

姚春華（1979—），女，浙江麗水人，工程師，碩士研究生，主要從事食品檢驗(yàn)測(cè)試工作，E-mail：ych985@163.com。