蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病的抑制效果初探

黃 宇，李國(guó)雷，廖 敏*，韓東道，張 楠，陳 娜

（1.浙江省亞熱帶土壤與植物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)研究實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058；2.象山縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江象山 315700；3.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江杭州 310058；4.寧波龍興生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司，浙江象山 315700）

蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病的抑制效果初探

黃 宇1，3，李國(guó)雷1，2，廖 敏1，3*，韓東道4，張 楠1，3，陳 娜1，3

（1.浙江省亞熱帶土壤與植物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)研究實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058；2.象山縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江象山 315700；3.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江杭州 310058；4.寧波龍興生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司，浙江象山 315700）

通過(guò)蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病孢子抑制及田間防效試驗(yàn)，探討對(duì)草莓白粉病的抑制潛力。結(jié)果表明，蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的EC50為總氨基酸21.81 mg·L-1。田間防效表明，在草莓白粉病發(fā)病期，連續(xù)3次噴施蚯蚓水解液，草莓白粉病能被有效控制，防效為80.7%～90.0%，蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病的田間防效的噴施濃度以50～100倍液較為適宜。同時(shí)蚯蚓水解液的使用不會(huì)對(duì)草莓的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響，反而是促進(jìn)草莓生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)有益生物也無(wú)不良影響，說(shuō)明蚯蚓水解液在草莓生產(chǎn)上具有很好的防病和促進(jìn)生長(zhǎng)的應(yīng)用前景。

蚯蚓水解液；草莓白粉??；抑制效果

草莓白粉病是因子囊菌亞門專性寄生真菌羽衣草單囊殼菌（Sphaerothecamacularis）侵染造成，是草莓生產(chǎn)中一種常發(fā)性病害，在世界各地均有分布［1-3］。我國(guó)南方一般10月下旬至11月上旬始發(fā)，12月至翌年4月為發(fā)生高峰期。為害導(dǎo)致草莓幼果停止發(fā)育，果面覆蓋一層白粉，隨著病情的加重，草莓果實(shí)品質(zhì)變差，甚至腐爛變質(zhì)，失去商品價(jià)值［4］。該病害已成為草莓生產(chǎn)主要障礙因子，給種植戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

草莓果實(shí)一般以直接入口鮮食為主，對(duì)果實(shí)農(nóng)藥殘留限量要求嚴(yán)格，目前生產(chǎn)上防治草莓白粉病常用的化學(xué)農(nóng)藥如腈菌唑、百菌清、粉銹寧等，易造成農(nóng)藥殘留［5］，同時(shí)由于多年的連續(xù)使用，使病菌產(chǎn)生抗性，造成防效下降。因此，尋找高效、安全的白粉病真菌抑制劑是草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟須解決的一個(gè)問(wèn)題。

蚯蚓是分解腐熟廢棄有機(jī)物效率最高的生物，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位，不但藥用價(jià)值大，而且蛋白質(zhì)含量高，約占鮮質(zhì)量的8%～10%，占干重的56%～66%。正常情況下，蚯蚓體內(nèi)含有低量的抗菌肽。孫振鈞［6］通過(guò)熱處理、超濾和分子篩等方法，從蚯蚓體液中純化得到相對(duì)分子量低于10 000的抗菌肽，發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的抑菌活性，且抗菌譜廣，熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。張希春等［7］研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體內(nèi)存在多種抗菌成分，特別是分子量較小的成分中含有性質(zhì)有別的2種及以上的抗菌肽類成分。賈久滿等［8］研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓水解液對(duì)大腸桿菌具有很好的抑制效果，這一現(xiàn)象在李彥青等［9］研究中也得到驗(yàn)證，這是蚯蚓水解液保留了抗菌肽的活性，同時(shí)還新增了有抗菌潛力的系列小分子肽緣故。可見(jiàn)，含有抗菌肽的蚯蚓水解液可作為一種新型的安全抑菌劑加以開(kāi)發(fā)利用。

蚯蚓消化道有10多種蛋白水解酶，這些酶類對(duì)蚯蚓蛋白有較強(qiáng)的水解活性。武金霞等［10-11］研究發(fā)現(xiàn)，利用蚯蚓自身水解酶分解蚯蚓蛋白質(zhì)，可獲得較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和富含生物活性物質(zhì)的蚯蚓水解液。筆者研究也發(fā)現(xiàn)，其成分主要為18種氨基酸和少量短肽，其中氨基酸占85%，短肽和小分子蛋白質(zhì)占12%～15%［12］。目前，蚯蚓水解液利用研究主要集中在氨基酸葉面肥生產(chǎn)原料，或作為動(dòng)物養(yǎng)殖的營(yíng)養(yǎng)液利用方面，利用其含抗菌肽活性因子控制作物微生物病害方面的研究等未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)初步探討蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌的抑制效果，旨在為防治草莓白粉病尋找高效、安全的抑制劑，解決草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸制約問(wèn)題，同時(shí)也為提高蚯蚓資源的附加值利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試草莓白粉病菌采自于象山縣東陳鄉(xiāng)東塔村的寧波龍興生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司的大棚草莓白粉病發(fā)生的果實(shí)上，采集后在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)室制成孢子懸浮液備用。

1.2 蚯蚓水解液制備

選用大平2號(hào)蚯蚓，洗凈并吐出體內(nèi)的食物殘?jiān)７Q取鮮蚯蚓500 g，用高速組織搗碎機(jī)搗碎，在pH 7.0、鮮蚯蚓與水重量比為1∶1.5、溫度50℃的條件下反應(yīng)48 h，取粗過(guò)濾液在4 500 r·m in-1下離心10 min，取上清液，封樣備用。

1.3 處理設(shè)計(jì)與測(cè)定方法

1.3.1 抑制率測(cè)定

通過(guò)測(cè)定蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)抑制率來(lái)確定抑菌效果［13］。將制備好的蚯蚓水解液稀釋不同倍數(shù)，與草莓白粉病菌孢子懸浮液混合，分別配制成含蚯蚓水解總氨基酸12.0、24.0、48.0、96.0和192.0 mg·L-1的草莓白粉病菌孢子懸浮液的混合液，以滅菌水配制成的草莓白粉病菌孢子懸浮液為對(duì)照，各取1滴（約0.25 m L）分別置入雙凹載玻片上，每處理重復(fù)3次；將凹面朝下，置于鋪有吸水濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，放入25℃培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)，24 h后于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野觀察，每個(gè)視野隨機(jī)檢查100個(gè)孢子，記錄孢子的萌發(fā)情況，凡孢子的芽管超過(guò)孢子直徑一半時(shí)即判為萌發(fā)孢子，計(jì)算萌發(fā)率和抑制萌發(fā)率以及EC50。

1.3.2 處理設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)于2015年3月15日至4月13日在寧波龍興生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司草莓大棚內(nèi)進(jìn)行，草莓品種為紅頰。該大棚歷年發(fā)生白粉病較為嚴(yán)重，施藥時(shí)正處于白粉病發(fā)病初期，少數(shù)果實(shí)開(kāi)始發(fā)病。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理：蚯蚓水解液50倍稀釋液，蚯蚓水解液100倍稀釋液，蚯蚓水解液200倍稀釋液，蚯蚓水解液400倍稀釋液，10%苯醚甲環(huán)唑水分散顆粒劑600倍稀釋液（防治草莓白粉病常用化學(xué)農(nóng)藥），清水對(duì)照（CK）。每處理重復(fù)3次，共18個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積20 m2，小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列。噴施時(shí)間第1次3月15日，第2次3月22日，第3次4月1日，采用背負(fù)式噴霧機(jī)噴施，均勻噴灑在草莓植株葉的正反面及幼果果面，每小區(qū)噴施1.5 L藥液。

1.3.3 調(diào)查方法和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

第1次噴施前（3月15日）調(diào)查病情基數(shù)，第1次噴施后7 d（3月22日）、第2次噴施后10 d（4月1日）、第3次噴施后12 d（4月13日）調(diào)查發(fā)病情況和防治效果。每小區(qū)對(duì)角線5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)取5株，每株調(diào)查所有果實(shí)，以每個(gè)果實(shí)上病斑面積占整個(gè)果實(shí)的百分比進(jìn)行病情分級(jí)。病害分級(jí)如下［14］：0級(jí)，葉片、果實(shí)無(wú)病；1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉、果面積的5%以下；3級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉、果面積6%～15%；5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉、果面積16%～25%；7級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉、果面積26%～50%；9級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉、果面積50%以上。同時(shí)，每次調(diào)查病害時(shí)觀察草莓植株生長(zhǎng)情況，考查蚯蚓水解液的安全性和促進(jìn)生長(zhǎng)情況。

根據(jù)病害調(diào)查結(jié)果計(jì)算病情指數(shù)和防治效果，采用鄧肯氏新復(fù)極差法（DMRT）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

病情指數(shù)=100×［（各級(jí)病葉病果數(shù)×病害級(jí)別數(shù)）］/（調(diào)查總?cè)~總果數(shù)×9）；

防治效果/%=100×（1—對(duì)照區(qū)噴施清水前病情指數(shù)×處理區(qū)噴施后病情指數(shù)÷對(duì)照區(qū)噴施清水后病情指數(shù)÷處理區(qū)噴施前病情指數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的影響

由表1可知，蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌孢子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，且隨著蚯蚓水解液濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。經(jīng)對(duì)蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的影響數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)抑制率的回歸方程，即：Y=0.125 5X+47.263，相關(guān)系數(shù)為r= 0.961 1，式中Y為萌發(fā)抑制率（%），X為蚯蚓水解液總氨基酸濃度（mg·L-1），可見(jiàn)蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)抑制率與蚯蚓水解液總氨基酸濃度存在良好的正相關(guān)關(guān)系。依據(jù)上述回歸方程，可推算出蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)抑制率的半最大效應(yīng)濃度（EC50）值，即EC50為總氨基酸21.81mg·L-1，可見(jiàn)蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的抑制效果明顯，這主要是由于蚯蚓水解液中含有一定量抗菌小分子肽之故［6-8］。因此，蚯蚓水解液除了可提供草莓氨基酸營(yíng)養(yǎng)之外，還具有對(duì)白粉病菌等良好的抑制效果，又可能成為替代防治草莓白粉病化學(xué)農(nóng)藥的環(huán)境友好型藥劑，具有一定市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景。

2.2 對(duì)草莓白粉病的田間防效

從表2可知，第1次施蚯蚓水解液之后的第7天考查，蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病的防效隨噴施濃度的增加而提高，蚯蚓水解液50、100、200和400倍稀釋液的平均防效分別為74.5%、68.6%、62.1%和58.0%。其中，100倍稀釋液防效與苯醚甲環(huán)唑化學(xué)農(nóng)藥的防效無(wú)顯著差異，而200倍和400倍稀釋液防效低于化學(xué)農(nóng)藥，50倍稀釋液防效高于化學(xué)農(nóng)藥，這可能是由于隨著蚯蚓水解液稀釋倍數(shù)的增加，單位數(shù)量?jī)?nèi)抗菌小分子肽等生理活性物質(zhì)濃度降低，導(dǎo)致抗菌效果下降的原因所致［6-8］。第2次施蚯蚓水解液后的第10天考查，蚯蚓水解液50、100、200和400倍稀釋液的平均防效分別為85.7%、81.8%、79.1%和76.6%，這種趨勢(shì)與第1次施蚯蚓水解液后的第7天考查結(jié)果相同。第3次施蚯蚓水解液后的第12天考查，蚯蚓水解液50、100、200和400倍稀釋液的平均防效分別為90.0%、83.8%、81.8%和80.7%，防效趨勢(shì)仍與第1和2次施蚯蚓水解液后的考查結(jié)果相同。由此可見(jiàn)，在草莓白粉病初發(fā)期，連續(xù)噴施蚯蚓水解液3次后，草莓白粉病的病情指數(shù)大幅下降，而空白對(duì)照區(qū)白粉病發(fā)生日趨嚴(yán)重。試驗(yàn)結(jié)果還表明，蚯蚓水解液的稀釋倍數(shù)應(yīng)控制在50～100倍，以保證優(yōu)于苯醚甲環(huán)唑化學(xué)農(nóng)藥的防治效果。此方法值得在草莓生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，防止直接入口鮮食水果因農(nóng)殘超標(biāo)危害身體健康。

表1 蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的影響

2.3 對(duì)草莓生長(zhǎng)安全性影響

在每次調(diào)查病害時(shí)，目測(cè)蚯蚓水解液對(duì)草莓葉片和幼果等生長(zhǎng)發(fā)育情況的影響，以判斷其安全性。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，噴施蚯蚓水解液的處理區(qū)未發(fā)現(xiàn)草莓的莖葉、花和果實(shí)有任何異常藥害癥狀發(fā)生。相反，與對(duì)照和噴施化學(xué)農(nóng)藥的處理區(qū)相比，噴施蚯蚓水解液的處理區(qū)植株長(zhǎng)勢(shì)更好，葉片顏色更深，果實(shí)顏色更鮮艷。

由表3可知，隨著蚯蚓水解液噴施濃度提高和次數(shù)增加，草莓近似葉面積有隨之增加的趨勢(shì)，且這一趨勢(shì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步得到強(qiáng)化，而噴施化學(xué)農(nóng)藥的處理區(qū)近似葉面積與對(duì)照無(wú)顯著差異，這可能因?yàn)轵球舅庖罕旧硎且环N氨基酸葉面營(yíng)養(yǎng)肥［15-17］，可為植株提供氨基酸和微量元素，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，達(dá)到藥肥一體之效果。同時(shí)，也未發(fā)現(xiàn)放養(yǎng)的授粉蜜蜂有異常死亡現(xiàn)象，說(shuō)明在草莓上噴施蚯蚓水解液對(duì)有益昆蟲是安全的，在草莓生產(chǎn)上具有很好的應(yīng)用前景。

表2 蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病田間防效

表3 不同濃度蚯蚓水解液對(duì)草莓近似葉面積的影響

3 小結(jié)

蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，其抑制孢子萌發(fā)的EC50為總氨基酸21.81 mg·L-1。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，在草莓白粉病初發(fā)期，連續(xù)噴施蚯蚓水解液3次，防效在80.7%以上，如選用適宜噴施濃度50～100倍且連續(xù)噴施3次，防效可達(dá)83.8%～90.0%。同時(shí)蚯蚓水解液還有促進(jìn)草莓生長(zhǎng)發(fā)育的作用，對(duì)有益生物無(wú)不良影響，對(duì)以鮮食為主的草莓生產(chǎn)有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S482.2+92

：A

：0528-9017（2016）12-2067-04

文獻(xiàn)著錄格式：黃宇，李國(guó)雷，廖敏，等.蚯蚓水解液對(duì)草莓白粉病的抑制效果初探［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（12）：2067-2070.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161246

2016-05-31

寧波市重大（重點(diǎn)）科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2013C11012）；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項(xiàng)（201003059）

黃 宇（1990—），男，湖南株洲人，碩士研究生，主要從事環(huán)境生態(tài)研究工作，E-mail：huangyuyuer@126.com。

廖 敏，研究員，博士，從事土壤化學(xué)與土壤生物化學(xué)研究工作，E-mail：liaom in@zju.edu.cn。