理化因子對(duì)茶尺蠖核型多角體病毒活性的影響

譚榮榮，王友平，毛迎新，王佳璐

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a.果樹茶葉研究所湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心果茶分中心，b.植保土肥研究所，湖北武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

理化因子對(duì)茶尺蠖核型多角體病毒活性的影響

譚榮榮1a，王友平1b，毛迎新1a，王佳璐2*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a.果樹茶葉研究所湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心果茶分中心，b.植保土肥研究所，湖北武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

研究了pH、溫度、紫外線和化學(xué)試劑處理對(duì)茶尺蠖核型多角體病毒活性的影響。結(jié)果表明，茶尺蠖核型多角體病毒在pH 7的環(huán)境中，活性最強(qiáng)，pH值升高或降低，茶尺蠖核型多角體病毒感染的茶尺蠖幼蟲的死亡率都會(huì)下降；當(dāng)水浴溫度達(dá)80℃時(shí)，病毒幾乎完全失活；紫外線處理32 h可明顯降低病毒活性；在4種化學(xué)試劑中，0.1%CuSO4對(duì)病毒活力影響較小，經(jīng)過(guò)乙醚和75%乙醇處理后的病毒活力有下降趨勢(shì)。

茶尺蠖核型多角體病毒；理化因子；病毒活性

茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，EoNPV）作為茶園主要害蟲茶尺蠖生物防治的重要手段之一，其優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、安全無(wú)害，能引起害蟲群體病毒疾病的流行傳播，在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可自然控制害蟲消長(zhǎng)，導(dǎo)致相繼世代害蟲持續(xù)帶毒，感染死亡。然而昆蟲病毒在自然條件下，易受陽(yáng)光、雨水及溫度等因素的影響，易于失活，殘效期不長(zhǎng)，直接影響防治效果［1］。

測(cè)定EcobNPV在不同理化條件下的穩(wěn)定性，不僅是其生理生化特性的一個(gè)重要方面，也是指導(dǎo)茶尺蠖大田防治的重要依據(jù)之一。本研究借鑒前人的方法和技術(shù)，以我國(guó)湖北茶園主要害蟲——茶尺蠖為材料，將部分純化的EcobNPV進(jìn)行不同處理，再通過(guò)人工感染，測(cè)定EcobNPV在不同理化條件下的活性［2-3］。

1 材料與方法

1.1 茶尺蠖病毒懸液制備

茶尺蠖核型多角體病毒利用茶尺蠖幼蟲活體增殖，收集病毒感染致死的昆蟲尸體，用PBS緩沖液充分研磨后，4層紗布過(guò)濾，將濾液置于4℃條件下離心，500 r·m in-1離心5 m in，棄沉淀，上清液再用3 500 r·m in-1離心30 m in。然后用適量緩沖液重新懸浮沉淀，3 500 r·min-1離心30 min。差速離心反復(fù)進(jìn)行多次，直至多角體懸液呈乳白色。病毒用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，使用等體積PBS緩沖液稀釋，于4℃冰箱保存待用。本試驗(yàn)中使用的茶尺蠖病毒水劑，病毒原液濃度為3.6×1010PIB· m L-1，使用終濃度為2×107PIB·m L-1。

1.2 供試蟲源與蟲齡

室內(nèi)用茶樹鮮葉連續(xù)飼養(yǎng)6代以上的茶尺蠖幼蟲2齡期。

1.3 處理設(shè)計(jì)

pH對(duì)EcobNPV活性的影響。用0.2 mol·L-1的Na2HPO4和0.1 mol·L-1的檸檬酸按不同比例配置成pH分別為4、6、7、8的緩沖溶液，用HCl配置pH為2的溶液，用NaOH配置pH分別為10、12的溶液。用上述各pH值溶液稀釋病毒液至使用終濃度，將稀釋后的病毒液置于常溫下保存24、240 h后對(duì)茶枝葉片進(jìn)行接毒，飼養(yǎng)茶尺蠖幼蟲。

溫度對(duì)EcobNPV活性的影響。將病毒原液稀釋至使用終濃度，盛于燒杯中，分別置于40、50、60、70、80、90、100℃水浴鍋中加熱，共7個(gè)處理。在加熱過(guò)程中用溫度計(jì)不斷攪拌病毒液并觀察溫度，待達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，使其保持恒溫30或60 min后取出冷卻供試。

紫外輻射對(duì)EcobNPV活性的影響。將涂有病毒多角體（病毒原液）的培養(yǎng)皿放在超凈工作臺(tái)中紫外燈管（30 W，波長(zhǎng)為200～300 nm，最強(qiáng)處波長(zhǎng)為255 nm）下進(jìn)行輻射，設(shè)置60、120、240、480、960和1 920 m in 6個(gè)時(shí)間梯度處理，然后將處理過(guò)的病毒稀釋至使用終濃度待用。

化學(xué)試劑對(duì)EcobNPV活力的影響。用乙醚、乙醇、CuSO4和甲醛處理，具體處理方法如下：（1）將病毒原液分別用40倍體積的乙醚和75%乙醇靜置懸浮4 h，離心除去化學(xué)試劑后稀釋至使用濃度待用；（2）另取適量病毒原液用0.1%CuSO4稀釋至使用濃度后直接處理茶枝葉片；（3）直接取適量病毒原液用蒸餾水稀釋至所需濃度，然后甲醛熏蒸3 h對(duì)茶枝葉片進(jìn)行接毒。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH對(duì)EcobNPV致病力的影響

pH值升高或降低，對(duì)病毒的致病力均有較大影響（表1）。在酸性范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，幼蟲的感染率也隨之升高，當(dāng)pH為4～6時(shí)，病毒致死率差異不顯著。堿性范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，對(duì)幼蟲的致病率顯著下降，pH 12條件下處理240 h，病毒幾乎完全失活。呂鴻聲［4］指出，中性溶液（pH值7）處理的病毒發(fā)病率最快，致病性最強(qiáng)，pH值升高或者降低都會(huì)影響病毒的感染率，延長(zhǎng)潛育期。本研究中，pH值升高和降低均降低了EcobNPV的感染率，pH為6、7和8的溶液對(duì)EcobNPV的致病率無(wú)顯著影響。

表1 不同pH值對(duì)EcobNPV致病力的影響

2.2 溫度對(duì)EcobNPV致病力的影響

溫度是影響病毒變性的重要因素之一，溫度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成蛋白質(zhì)變性，從而使病毒失活。隨著溫度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒活性逐漸降低，感病幼蟲死亡率也逐漸降低。在處理溫度區(qū)域內(nèi)，病毒活力受到不同程度的抑制作用，死亡率與CK（表1）相比明顯降低（圖1）。80℃水浴處理30 min，幼蟲仍有部分死亡，說(shuō)明該病毒有部分保持了活力，對(duì)高溫耐受力較強(qiáng)。當(dāng)溫度升至90℃時(shí)，EcobNPV完全失活。方差分析表明，60、70和80℃分別處理30 min，各處理之間的病毒致死率差異達(dá)極顯著水平；60、70和80℃分別處理60 min，各處理之間的病毒致死率差異也均達(dá)極顯著水平。

圖1 不同溫度下處理EcobNPV感染茶尺蠖幼蟲的死亡率

2.3 紫外線處理對(duì)EcobNPV致病力的影響

紫外線輻射對(duì)生物傷害或致死的主要原因是使有機(jī)體的遺傳物質(zhì)DNA發(fā)生變化，從而造成遺傳變異或死亡。紫外輻射強(qiáng)度一定時(shí)，EcobNPV的活性與照射時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，隨著照射時(shí)間的增長(zhǎng)，EcobNPV的活性逐漸降低（表2）。EcobNPV經(jīng)紫外線照射32 h后，飼毒幼蟲的死亡率僅為5.6%，病毒已幾乎完全喪失活性。

表2 紫外照射不同時(shí)間對(duì)EcobNPV致病力的影響

2.4 化學(xué)試劑對(duì)EcobNPV致病力的影響

不同化學(xué)試劑對(duì)EcobNPV活性的影響程度不一，但差異不大。0.1%CuSO4、乙醚、甲醛、75%乙醇對(duì)EcobNPV都沒(méi)有較強(qiáng)的滅活作用，處理后病毒液均保持較高的穩(wěn)定性，其死亡高峰期也相對(duì)集中（表3）。能使蛋白質(zhì)變性的甲醛未能使EgNPV喪失感染活性，致使處理幼蟲全部感染病毒死亡，這可能與病毒的外層囊膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表3 不同化學(xué)試劑對(duì)EcobNPV致病力的影響

3 小結(jié)與討論

作為昆蟲病原微生物，病毒在昆蟲疾病流行中起著十分重要的作用。因其具有對(duì)宿主專一性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境友好等特性，日益為人們所重視，應(yīng)用前景十分廣闊。環(huán)境中的各種生態(tài)因子，對(duì)昆蟲病毒的穩(wěn)定性有明顯影響，因此，關(guān)于昆蟲病毒穩(wěn)定性的研究是病毒生態(tài)學(xué)研究中的重要內(nèi)容［4-7］。本文從pH值、溫度、紫外線和化學(xué)試劑處理4個(gè)方面對(duì)茶尺蠖核型多角體病毒的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，以期對(duì)昆蟲病毒流行學(xué)研究以及利用病毒制劑進(jìn)行害蟲的持續(xù)控制提供依據(jù)。研究結(jié)果顯示，茶尺蠖核型多角體病毒（EcobNPV）對(duì)酸堿度和溫度有較寬的適應(yīng)范圍，具有良好的穩(wěn)定性；經(jīng)紫外線和各種不同的化學(xué)試劑處理，也能保持較高的毒性。

溫度對(duì)病毒活性的影響主要表現(xiàn)在其宿主感染后的死亡率，隨著溫度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒活性降低。茶尺蠖核型多角體病毒的穩(wěn)定性受處理溫度和處理時(shí)間的共同作用，對(duì)一定時(shí)間的亞高溫（40～60℃）和短時(shí)（30 m in以內(nèi)）的高溫（80℃以上）有一定的耐受性。

不同pH毒力影響試驗(yàn)中，處理組幼蟲死亡特征為典型的桿狀病毒感染所致，病毒在pH 7的環(huán)境中活性最強(qiáng)，pH值升高或降低，病毒致病率都會(huì)下降；在pH值4和pH 6～8時(shí)，其感病幼蟲的死亡率沒(méi)有顯著性差異。由此可以得出，在pH值6～8時(shí)，EcobNPV的穩(wěn)定性較高。

紫外線照射能使生物體內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致瞬時(shí)的或不可逆的細(xì)胞損傷。本試驗(yàn)中，在適宜條件下（紫外線處理60 min），EcobNPV能至少保持感染活性數(shù)小時(shí)，然而隨著病毒接受紫外線積累量的增加，機(jī)體清除這些氧自由基的能力下降、抗氧化能力減弱造成細(xì)胞損傷，直至機(jī)體死亡。所以當(dāng)輻射時(shí)間延長(zhǎng)至32 h時(shí)，病毒失去活性。

EcobNPV對(duì)常用的化學(xué)試劑有較強(qiáng)的抵抗力。分別使用0.1%CuSO4、乙醚、甲醛和75%乙醇進(jìn)行處理時(shí)，病毒仍保持較高的侵染力?？梢娫谧匀画h(huán)境中，該病毒抗逆境的能力較強(qiáng)，普通的去污劑或蛋白質(zhì)變性劑，均不能使EcobNPV完全滅活。

綜上所述，在茶尺蠖核型多角體病毒制劑的加工和野外施用過(guò)程中，應(yīng)注意以下幾個(gè)問(wèn)題：（1）在制劑加工過(guò)程中注意避免高溫環(huán)境［8］。水劑可忍受30 min內(nèi)50℃以下的高溫環(huán)境，但最好不要超過(guò)40℃；（2）在低溫環(huán)境下保存病毒；（3）在使用時(shí)除注意應(yīng)在低齡幼蟲期施用外，更應(yīng)注意避免在高溫烈日下施用，夏季時(shí)可在清晨或傍晚進(jìn)行施藥。

［1］ ERLANDSON M.Insect pest control by viruses［M］.Oxford：Academ ic Press，2008.

［2］ 殷燦.美國(guó)白蛾核型多角體病毒的穩(wěn)定性研究［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［3］ 殷燦，劉笛，任驥，等.溫度對(duì)美國(guó)白蛾核型多角體病毒活性的影響［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，46（3）：353-356.

［4］ 呂鴻聲.昆蟲病毒與昆蟲病毒病［M］.北京：科學(xué)出版社，1982.

［5］ 孫新城，景建洲，陳小科.桿狀病毒的生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（10）：16-18.

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（責(zé)任編輯：侯春曉）

S476+.13

：A

：0528-9017（2016）12-2030-03

文獻(xiàn)著錄格式：譚榮榮，王友平，毛迎新，等.理化因子對(duì)茶尺蠖核型多角體病毒活性的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（12）：2030-2032.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161232

2016-05-25

國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（2011-620-005-003-04）

譚榮榮（1981—），女，湖北襄陽(yáng)人，碩士，助理研究員，從事茶樹植物保護(hù)研究工作，E-mail：tanrongrong1981 @163.com。

王佳璐（1980—），女，重慶人，博士，副教授，從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治研究工作，E-mail：wangjialu@mail.hzau.edu.cn。