整合素α3在髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)侵襲作用的影響

王勇+王玉社+陳航

【摘要】 目的 研究整合素α3在髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)侵襲作用的影響。方法 應(yīng)用免疫磁珠法（MACS）從髓母細(xì)胞瘤標(biāo)本中獲得CD133+和CD133-細(xì)胞， 通過(guò)免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)CD133+ 和CD133-兩組細(xì)胞中整合素α3的表達(dá)， 運(yùn)用transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察使用整合素α3抗體和未使用整合素抗體對(duì)CD133+侵襲作用的影響。結(jié)果 整合素α3在CD133+組的表達(dá)顯著高于CD133-組（P<0.01）；使用整合素α3單克隆抗體組穿膜細(xì)胞數(shù)目為（26.53±3.71）， 低于空白對(duì)照組的（54.76±6.27）（P<0.01）。結(jié)論 整合素α3在髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的侵襲中起重要作用。

【關(guān)鍵詞】 髓母細(xì)胞瘤；干細(xì)胞；整合素α3；侵襲

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.30.013

【Abstract】 Objective To research expression of integrin α3 in medulloblastoma stem cells and its influence on invasion effect. Methods Magnetic activated cell sorting （MACS） was applied to taken CD133+ and CD133- cells from medulloblastoma samples. Immunohistochemistry and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （PCR） were used to detect expression of integrin α3 in CD133+ and CD133- cells. Influence by application of integrin α3 antibody on CD133+ invasion effect was observed by transwell cell invasion assay. Results Expression of integrin α3 in CD133+ group was obviously higher than that in CD133- group （P<0.01）. Monoclonal antibody had lower transmembrane cell number by integrin α3 as （26.53±3.71） than （54.76±6.27） in the blank control group （P<0.01）. Conclusion Integrin α3 shows important effect in invasion of medulloblastoma stem cells.

【Key words】 Medulloblastoma； Stem cells； Integrin α3； Invasion

髓母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的腦惡性腫瘤， 容易復(fù)發(fā)， 同時(shí)易沿蛛網(wǎng)膜下腔播散轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程， 有多種生物化學(xué)因子參與其中[1， 2]。本研究通過(guò)檢測(cè)髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中整合素α3的表達(dá)， 同時(shí)應(yīng)用抗整合素單克隆抗體， 觀察其對(duì)侵襲作用的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞取自2013年～2015年河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)標(biāo)本。

1. 2 方法

1. 2. 1 髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 腫瘤手術(shù)標(biāo)本剪碎后胰蛋白酶消化， 吹打成單細(xì)胞懸液；過(guò)濾、離心收集細(xì)胞， 培養(yǎng)于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液中（含Neurobasal培養(yǎng)基、1：50 B27添加劑、20 μg/L成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、20 μg/L表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子）， 在37℃、 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 培養(yǎng)所得細(xì)胞呈神經(jīng)球狀生長(zhǎng)。

1. 2. 2 免疫磁珠法分選CD133+和CD133-細(xì)胞 使用免疫磁珠細(xì)胞分選試劑盒（Mihenyi Biotech公司）分離出CD133+和CD133-細(xì)胞， 并使用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行純度測(cè)定。

1. 2. 3 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（QRT-PCR）檢測(cè) QRT-PCR檢測(cè)分選后 CD133+細(xì)胞、CD133-細(xì)胞中整合素α3的表達(dá)， 上游引物5-GGAAGGAACAAAGACAGGCAAAC-3， 下游引物5-GGTA GTGGTGAGTGAGAAGTGGC-3。

1. 2. 4 免疫組化 本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法， 整合素α3多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司， 工作濃度為1：100。

1. 2. 5 侵襲實(shí)驗(yàn) 將CD133+細(xì)胞分為兩組進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)， 一組加入抗整合素α3單克隆抗體（購(gòu)自武漢博士德公司）， 濃度為100 μg/ml；另一組為空白對(duì)照組。將Transwell小室加在24孔板上， 上室進(jìn)行鋪膠， 每孔加入100 μl（每孔約含2×104 個(gè)細(xì)胞）無(wú)血清的細(xì)胞懸液， 下室加入500 μl含10% 胎牛血清的DMEM， 種板后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后， 取出上室， 棄掉上室中培養(yǎng)基， 多聚甲醛溶液固定， 結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡觀察， 拍照計(jì)數(shù)。

1. 3 觀察指標(biāo) 觀察CD133+ 和CD133-兩組中整合素α3的表達(dá)、每個(gè)視野穿過(guò)小室聚碳酸酯膜的平均細(xì)胞數(shù)目。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 CD133+ 和CD133-兩組中整合素α3的表達(dá) QRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示， CD133+ 和CD133-兩組中整合素α3mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（3.985±0.236）、（0.047±0.003）， 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。免疫組化顯示CD133+組中整合素α3高表達(dá)， 而CD133-組低表達(dá)。另外， 整合素α3陽(yáng)性的干細(xì)胞主要聚居在血管周圍。

2. 2 抗整合素單克隆抗體應(yīng)用后對(duì)髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 使用整合素α3單克隆抗體組與空白對(duì)照組相比， 干細(xì)胞侵襲能力下降， 每個(gè)視野穿過(guò)小室聚碳酸酯膜的平均細(xì)胞數(shù)目顯著降低， 兩組的細(xì)胞數(shù)目分別為（26.53±3.71）、（54.76±6.27）， 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

近年來(lái)， 越來(lái)越多的證據(jù)支持腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)， 并認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和對(duì)治療的抵抗中發(fā)揮著重要作用。干細(xì)胞特征的維持與干細(xì)胞所處的微環(huán)境（Niche， 壁龕）有密切關(guān)系。干細(xì)胞與基底膜的粘附是干細(xì)胞維持其特性的基本條件。干細(xì)胞通過(guò)各種粘附分子介導(dǎo)與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附， 從而使干細(xì)胞定居于壁龕中。整合素作為一類重要的細(xì)胞表面受體， 是重要的粘附分子之一。干細(xì)胞主要通過(guò)表達(dá)整合素實(shí)現(xiàn)對(duì)基底膜各種成分的粘附。干細(xì)胞對(duì)基底膜的脫粘附是誘導(dǎo)干細(xì)胞脫離干細(xì)胞群進(jìn)入分化周期的重要調(diào)控機(jī)制。

整合素在多種惡性腫瘤中的表達(dá)明顯高于周圍的癌旁組織， 并且與預(yù)后明顯負(fù)相關(guān)， 說(shuō)明它在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。但關(guān)于其在干細(xì)胞中的表達(dá)報(bào)道較少。本研究通過(guò)免疫磁珠法分選出CD133+的干細(xì)胞和CD133-的細(xì)胞。然后應(yīng)用免疫組化和QRT-PCR檢測(cè)兩組整合素α3的表達(dá)情況， 發(fā)現(xiàn)CD133+組明顯高于 CD133-組（P<0.01）。Lathia等[3]發(fā)現(xiàn)整合素不僅在CD133+的腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)；而且在Olig2+的腫瘤干細(xì)胞中同樣高表達(dá)。反過(guò)來(lái)， 他們收集整合素陽(yáng)性的腫瘤干細(xì)胞， 培養(yǎng)后可以在更高頻率更短時(shí)間形成腫瘤。

神經(jīng)干細(xì)胞一個(gè)重要特征是它們聚集在血管周圍的壁龕內(nèi)。本研究證實(shí)了上述結(jié)論， 鏡下發(fā)現(xiàn)整合素陽(yáng)性的干細(xì)胞主要聚居在血管周圍。Lathia等[3]還發(fā)現(xiàn)60%表達(dá)整合素α6的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞位于血管5 μm以內(nèi)。并且通過(guò)免疫組化雙染發(fā)現(xiàn)整合素和CD133+在血管周圍區(qū)域聯(lián)合表達(dá)。

正常情況下， 干細(xì)胞寄居在組織或器官特定的壁龕中， 破壞腫瘤干細(xì)胞居住的壁龕可以消滅腫瘤干細(xì)胞[4]。在本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用抗整合素單克隆抗體使粘附于基底膜的腫瘤干細(xì)胞脫離， 從而破壞了干細(xì)胞的壁龕。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)照組相比， 穿膜細(xì)胞數(shù)減少， 細(xì)胞的侵襲活動(dòng)能力下降。

綜上所述， 整合素在髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中的高表達(dá)， 以及通過(guò)抗整合素單克隆抗體破壞腫瘤干細(xì)胞的壁龕， 可使干細(xì)胞侵襲能力下降。整合素可作為將來(lái)治療髓母細(xì)胞瘤的一個(gè)方向。

參考文獻(xiàn)

[1] 王勇， 梁慶華， 史錫文. uPA和FAK在髓母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥， 2012， 7（20）：40-42.

[2] 王勇， 毛伯鏞， 程宏偉， 等. uPA和KDR在髓母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義.中華神經(jīng)外科雜志， 2003， 19（2）：106-108.

[3] Lathia JD， Gallagher J， Heddleston JM， et al. Integrin alpha 6 regulates glioblastoma stem cells. Cell Stem Cell， 2010， 6（5）：421-432.

[4] Nakada M， Nambu E， Furuyama N， et al. Integrin α3 is overexpressed in glioma stem-like cells and promotes invasion. Br J Cancer， 2013， 108（12）：2516-2524.

[收稿日期：2016-10-25]