• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR—21—5p在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用研究

    2016-12-27 18:05:17張洪亮董天崴張磊藝
    關(guān)鍵詞:肺動(dòng)脈高壓調(diào)控

    張洪亮 董天崴 張磊藝

    [摘要] 目的 研究miR-21-5p在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病中的調(diào)控機(jī)制。 方法 應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-21-5p在正常人和先天性心臟病伴肺動(dòng)脈高壓患者血清,以及常氧和缺氧處理肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá);利用Edu滲入法以及劃痕實(shí)驗(yàn)研究miR-21-5p對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的影響;應(yīng)用Targetscan軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 肺動(dòng)脈高壓患者血清miR-21-5p水平顯著高于正常人血清(P < 0.001);與常氧相比,缺氧處理肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞明顯促進(jìn)miR-21-5p表達(dá)(P < 0.01);miR-21-5p能夠促進(jìn)缺氧條件下的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移;雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證明miR-21-5p能夠結(jié)合骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPR2)的3UTR;鑒定miR-21-5p在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中靶向BMPR2基因。 結(jié)論 miR-21-5p調(diào)控靶基因BMPR2參與肺動(dòng)脈高壓發(fā)病。

    [關(guān)鍵詞] 肺動(dòng)脈高壓;microRNA;骨形成蛋白Ⅱ型受體;調(diào)控

    [中圖分類號(hào)] R543.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721(2016)10(b)-0012-04

    [Abstract] Objective To reveal the role of miR-21-5p in the development of pulmonary arterial hypertention (PAH). Methods qRT-PCR method was used to detect the expression of miR-21-5p in the serum of healthy donors and patients with PAH associated with congenital heart disease (CHD-PAH), and the pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) exposed to normoxia and hypoxia. The effects of miR-21-5p on hypoxia-induced PASMC proliferation and migration were detected by Edu incorporation and wound assay. The target gene of miR-21-5p was predicted by targetscan and validated by luciferase report assay. Results miR-21-5p level was significantly increased in the serum of CHD-PAH patient as compared with healthy donors (P < 0.001). In addition, the expression of miR-21-5p was significantly induced in PASMC treated by hypoxic as compared with normoxia (P < 0.01). Functional analysis revealed that miR-21-5p significantly enhanced hypoxia-induced PASMC proliferation and migration. Finally, dual-luciferase reporter system proved miR-21-5p could integrate with BMPR2 3UTR, then BMPR2 was identified as a direct target of miR-21-5p. Conclusion The study demonstrates that miR-21-5p is involved in regulating PAH by targeting BMPR2.

    [Key words] Pulmonary arterial hypertension; microRNA; BMPR2; Regulation

    肺動(dòng)脈高壓是以肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高、肺血管阻力增加和肺小血管重構(gòu)為特征的肺血管疾病[1]。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,使得肺小動(dòng)脈內(nèi)徑變細(xì),最終肺動(dòng)脈阻力增加,壓力升高為其病理學(xué)特征[2-3]。

    microRNA(miRNA)是一類高度保守、長(zhǎng)度為20~25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA[4]。miRNA通過(guò)與靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)特異結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因進(jìn)行調(diào)控[5]。研究表明,miRNA參與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[6-7]。miRNA通過(guò)促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分化和抗凋亡效應(yīng)來(lái)參與肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)程[8-9]。本研究對(duì)miR-21-5p調(diào)控BMPR2參與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行初步探索。

    1 材料與方法

    1.1 患者血清標(biāo)本采集

    血清標(biāo)本來(lái)源于北京阜外醫(yī)院先天性心臟病伴有肺動(dòng)脈高壓(CHD-PAH)患者及健康人各24例。肺動(dòng)脈高壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)為在海平面靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管檢查肺動(dòng)脈收縮壓>4 kPa(30 mmHg)和/或肺動(dòng)脈平均壓>3.33 kPa(25 mmHg)。血液樣本在室溫下靜置1 h,4℃離心機(jī)3000 r/min離心10 min,上清液保存于-80℃冰箱。

    1.2 miR-21-5p實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)

    應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)試劑盒(深圳盎然生物)進(jìn)行檢測(cè)。miRNA經(jīng)加poly A后立即逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)形成cDNA,snoRNA44作為內(nèi)參。每個(gè)樣本PCR反應(yīng)做3個(gè)復(fù)孔,引物如下:miR-21-5p 5′-GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCAACAT-3′(RT),5′-TTCGGTAGCTTACAGACTGA-3′(Forward); SNORD44:5′ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGTCAG-3′(RT),5′-TGGCCTGGATGATGATAAGCA-3′ (Forward)。

    1.3 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

    人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HPASMC)購(gòu)自美國(guó)Science Cell公司,大鼠肺動(dòng)脈平滑肌原代細(xì)胞(RPASMC)分離自SD大鼠[北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):SCXK(京)2011-0011]肺動(dòng)脈。

    1.4 靶基因3-UTR熒光素酶載體及其突變載體的構(gòu)建

    以大鼠的基因組DNA為模板,將pGL3-ccdb載體經(jīng)雙酶切后與基因的3-UTR產(chǎn)物連接。BMPR2的3-UTR突變引物,擴(kuò)增產(chǎn)物連接到雙酶切后的pGL3-ccdb載體,連接后轉(zhuǎn)化酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序分析。

    1.5 BMPR2蛋白表達(dá)檢測(cè)

    采用Western blot法進(jìn)行蛋白檢測(cè)。4%~10%的預(yù)制膠電泳分離蛋白質(zhì),經(jīng)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,一抗4℃搖床孵育過(guò)夜,用Totallab TL100圖像分析軟件對(duì)特異條帶進(jìn)行灰度掃描,并用相對(duì)灰度值表示蛋白相對(duì)含量。一抗?jié)舛确謩e為:抗BMPR2(Abcam)1∶1000,抗β-Tubulin(Santa Cruz)1∶2000;二抗?jié)舛葹?∶2000。

    1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    根據(jù)試劑盒(廣州銳博生物),接種細(xì)胞于48孔板,加入20 μmol/L EdU繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,用4%多聚甲醛室溫固定30 min,0.5%Triton X-100透化10 min,每孔細(xì)胞加入150 μL染色反應(yīng)液反應(yīng)30 min。DNA用1×Hochest (150 μL/孔)染色5 min,在熒光顯微鏡下拍照。

    1.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

    細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)進(jìn)行劃痕(每組劃3~5個(gè)位置),更換成含0.5%FBS的SmGM-2培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理,并標(biāo)記和拍照,所有細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn);以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-21-5p在CHD-PAH患者血清中及缺氧條件下肺動(dòng)脈平滑細(xì)胞中的表達(dá)

    RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:miR-21-5p在CHD-PAH血清中表達(dá)升高,與正常人血清樣本比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.001);RPASMC和HPASMC分別在常氧條件下培養(yǎng)48 h以及缺氧條件下分別培養(yǎng)12、24、48 h,收集細(xì)胞后檢測(cè)miR-21-5p的表達(dá),結(jié)果顯示缺氧條件下miR-21-5p的表達(dá)升高最明顯,與常氧比較在24 h達(dá)到高峰值(P < 0.001)。

    2.2 miR-21-5p對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響

    觀察在缺氧條件下分別轉(zhuǎn)染miRNA-control、miR-21-5p mimic、anti-cnotrol、anti-miR-21-5p后對(duì)HPASMC增殖影響。從圖2(封四)結(jié)果可見(jiàn),與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)miR-21-5p能促進(jìn)HPASMC增殖(P < 0.01),相反,當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-21-5p拮抗物后抑制了HPASMC增殖(P < 0.01)。

    2.3 miR-21-5p在人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用

    實(shí)驗(yàn)表明,在缺氧24 h條件下miR-21-5p具有促進(jìn)HPASMC遷移作用(P < 0.01);應(yīng)用miR-21-5p抑制物缺氧24 h后,anti-21-5p抑制了HPASMC的遷移功能(P < 0.01)。

    2.4 miR-21-5p靶基因預(yù)測(cè)及3-UTR熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證

    TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)候選靶基因中BMPR2的3-UTR與miR-21-5p結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-21-5p使野生型BMPR2報(bào)告載體熒光素酶活性下降,與野生型對(duì)照組比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01),突變的熒光素酶報(bào)告基因的活性與對(duì)照組比較大致不變(P > 0.05)(圖4B)。

    2.5 miR-21-5p抑制內(nèi)源性BMPR2的表達(dá)

    與對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic組中BMPR2表達(dá)水平明顯上調(diào)(P < 0.001),轉(zhuǎn)染miR-21-5p inhibitor組BMPR2表達(dá)水平明顯降低(P < 0.001)(圖5A、B)。應(yīng)用Western blot檢測(cè)BMPR2蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與mimic-control相比,過(guò)表達(dá)miR-21-5p BMPR2蛋白表達(dá)下降;抑制miR-21-5p的表達(dá),能使HPASMC中BMPR2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(圖5C)。

    3 討論

    既往研究證明miRNA參與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制[10-11]。本研究檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓患者血清及缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中miR-21-5p表達(dá)升高,細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)在缺氧條件下miR-21-5p具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移功能,應(yīng)用Target scan在線軟件預(yù)測(cè)miR-21-5p靶基因?yàn)锽MPR2,實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-21-5p通過(guò)靶向BMPR2參與肺動(dòng)脈高壓的細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)過(guò)程。

    肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中BMPR2基因突變會(huì)引發(fā)肺動(dòng)脈高壓易感性[12-13]。BMPR2是轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β家族的重要成員,很早就有實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMPR2基因雜合子突變是肺動(dòng)脈高壓家族患者人群的重要遺傳易感因素[14]。在肺動(dòng)脈高壓患者的家族人群檢測(cè)結(jié)果顯示:大約有75%的家庭中檢測(cè)到BMPR2基因突變[15]。實(shí)驗(yàn)證明,BMPR2和其下游信號(hào)途徑在肺血管重構(gòu)中扮演著重要角色,通過(guò)激活BMPR2基因阻止細(xì)胞周期從而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分化[16-17]。

    microRNA參與肺動(dòng)脈高壓的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)在多個(gè)研究中得到證實(shí),miR-145通過(guò)靶向BMPR2參與肺動(dòng)脈高壓[18],抑制miR-20a導(dǎo)致BMPR2下游基因Id-1和Id-2的激活,從而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖[19]。miR-21在肺動(dòng)脈高壓的動(dòng)物模型肺組織中高表達(dá),通過(guò)激活RhoB信號(hào)途徑促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件下,過(guò)表達(dá)miR-21-5P具有促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖功能。說(shuō)明在缺氧條件下,miR-21-5p對(duì)肺動(dòng)脈的重構(gòu)過(guò)程具有重要的作用。

    本研究只探討了miR-21-5p通過(guò)BMPR2基因?qū)PASMC增殖和遷移的影響,Target scan軟件預(yù)測(cè)miR-21-5p同時(shí)靶向多個(gè)靶基因,其他靶基因是否同時(shí)參與了肺動(dòng)脈高壓的調(diào)控需要下一步驗(yàn)證。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Leopold JA,Maron BA. Molecular Mechanisms of Pulmonary Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension [J]. Int J Mol Sci,2016,17(5):761-775.

    [2] Archer SL,Weir EK,Wilkins MR. Basic science of pulmonary arterial hypertension for clinicians:new concepts and experimental therapies [J]. Circulation,2010,121 (18):2045-2066.

    [3] Humbert M,Morrel NW,Archer SL,et al. Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertension [J]. J Am Coll Cardiol,2004,43(12):108-124.

    [4] Chen CZ,Li L,Lodish,et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation [J]. Science,2004,303(56):83–86.

    [5] Bartel DP. MicroRNAs:genomics, biogenesis, mechanism, and function [J]. Cell,2004,116(2):281-297.

    [6] Dang LT,Lawson ND,F(xiàn)ish JE. MicroRNA control of vascular endothelial growth factor signaling output during vascular development [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013,33(2):193-200.

    [7] Joshi SR,McLendon JM,Comer BS,et al. MicroRNAs-control of essential genes: Implications for pulmonary vascular disease [J]. Pulm Circ,2011,1 (3):357-364.

    [8] Brock M,Trenkmann M,Gay RE,et al. Interleukin-6 modulates the expression of the bone morphogenic protein receptor type II through a novel STAT3-microRNA cluster 17/92 pathway [J]. Circ Res,2009,104(10):1184-1191.

    [9] Jin Y,Chen B,Tipple TE,et al. Arginase II is a target of miR-17-5p and regulates miR-17-5p expression in human pulmonary artery smooth muscle cells [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2014,307(2):197-204.

    [10] Caruso P,Maclean MR,Khanin R,et al. Dynamic changes in lung microRNA profiles during the development of pulmonary hypertension due to chronic hypoxia and monocrotaline [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010, 30(4):716-723.

    [11] Zeng Y,Liu HT, Gou DM,et al. Hypoxia inducible factor-1 mediates expression of miR-322:potential role in proliferation and migration of pulmonary arterial smooth muscle cells [J].Scientific Repotrs,2015,5(3):12098-120109.

    [12] Jones PL,Cowan KN,Rabinovitch M,et al. Tenascin-C, proliferation and subendothelial fibronectin in progressive pulmonary vascular disease [J]. Am J Pathol,1997, 150(4):1349-1360.

    [13] Malenfant S,Neyron AS,Paulin R,et al. Signal transduction in the development of pulmonary arterial hypertension [J]. Pulm Circ,2013,3(2):278-293.

    [14] Deng Z,Morse JH,Slager SL,et al. Familial primary pulmonary hypertension(gene PPH1)is caused by mutations in the bone morphogenetic protein receptor-II gene [J]. Am J Hum Genet,2000,67(3):737-744.

    [15] Soubrier F,Chung WK,Machado R,et al. Genetics and genomics of pulmonary arterial hypertension [J]. J Am Coll Cardiol,2013,62(25):13-21.

    [16] Wang J,Song Y,Zhang Y,et al. Cardiomyocyte overexpression of miR-27b induces cardiac hypertrophy and dysfunction in mice [J]. Cell Res,2012,22(3):516-527.

    [17] Yang J,Li X,AlLamki RS,et al. Smad-dependent and smad-independent induction of id1 by prostacyclin analogues inhibits proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells in vitro and in vivo [J]. Circ Res,2010, 107(2):252-262.

    [18] Caruso P,Dempsie Y,Stevens HC,et al. A Role for miR-145 in Pulmonary Arterial Hypertension:Evidence From Mouse Models and Patient Samples[J]. Circ Res,2012,111(3):290-300.

    [19] Brock M,Samillan VJ,Trenkmann M,et al. AntagomiR directed against miR-20a restores functional BMPR2 signalling and prevents vascular remodelling in hypoxia-induced pulmonary hypertension [J]. European Heart Journal,2014,35(45):3203-3211.

    [20] Parikh VN,Jin RC,Rabello S,et al. MicroRNA-21 Integrates Pathogenic Signaling to Control Pulmonary Hypertension: Results of a Network Bioinformatics Approach [J]. Circulation,2012,125(12):1520-1532.

    (收稿日期:2016-07-13 本文編輯:程 銘)

    猜你喜歡
    肺動(dòng)脈高壓調(diào)控
    心理調(diào)控在中小學(xué)管理中的有效應(yīng)用
    甘肅教育(2020年4期)2020-09-11 07:41:20
    如何調(diào)控困意
    經(jīng)濟(jì)穩(wěn)中有進(jìn) 調(diào)控托而不舉
    肺動(dòng)脈高壓靶向藥物治療經(jīng)濟(jì)學(xué)研究進(jìn)展
    先天性心臟病合并心臟聲帶綜合征患兒心臟矯治術(shù)后肺動(dòng)脈壓力及聲帶癥狀的變化
    法舒地爾對(duì)肺動(dòng)脈高壓血管重塑中ROCK及ET—1活性的影響
    順勢(shì)而導(dǎo) 靈活調(diào)控
    超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)血液透析患者并發(fā)肺動(dòng)脈高壓
    嬰幼兒室間隔缺損合并肺動(dòng)脈高壓的外科治療
    重度COPD合并肺動(dòng)脈高壓患者心肺運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)參數(shù)研究
    永久免费av网站大全| e午夜精品久久久久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 热re99久久国产66热| 一二三四在线观看免费中文在| 999久久久国产精品视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 成人国产av品久久久| 人人澡人人妻人| 黄色视频在线播放观看不卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黄片无遮挡物在线观看| 在线观看国产h片| av女优亚洲男人天堂| 精品亚洲成国产av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 又大又黄又爽视频免费| 免费观看性生交大片5| 一区二区三区激情视频| 尾随美女入室| 国产精品无大码| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产免费视频播放在线视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 制服诱惑二区| 成人影院久久| 超碰97精品在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品免费视频内射| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 1024视频免费在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 最近手机中文字幕大全| 亚洲国产看品久久| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲av福利一区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 伊人久久国产一区二区| 精品一区二区三区av网在线观看 | av视频免费观看在线观看| 永久免费av网站大全| 色综合欧美亚洲国产小说| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 成年动漫av网址| 51午夜福利影视在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一本久久精品| 久久久国产欧美日韩av| 在线天堂最新版资源| 婷婷色麻豆天堂久久| 免费在线观看黄色视频的| 日韩中文字幕视频在线看片| 中国国产av一级| 亚洲国产欧美网| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久av网站| 国产精品国产三级专区第一集| 国产视频首页在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久久久久久久久久免费av| 午夜老司机福利片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲人成77777在线视频| 成人国产麻豆网| 色播在线永久视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 一本久久精品| 美女中出高潮动态图| 国产伦人伦偷精品视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩免费高清中文字幕av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美xxⅹ黑人| 国产视频首页在线观看| 飞空精品影院首页| 成人亚洲欧美一区二区av| av片东京热男人的天堂| 久久久久网色| 尾随美女入室| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产爽快片一区二区三区| videosex国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产精品蜜桃在线观看| 99国产精品免费福利视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成人91sexporn| 一区二区三区乱码不卡18| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 国产精品 国内视频| 久久久国产一区二区| 下体分泌物呈黄色| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产人伦9x9x在线观看| 另类精品久久| 国产精品.久久久| 国产成人免费观看mmmm| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品三级大全| 国产精品国产三级国产专区5o| 熟女av电影| 香蕉国产在线看| 久久综合国产亚洲精品| 中文字幕亚洲精品专区| 午夜福利在线免费观看网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美日韩av久久| 精品人妻在线不人妻| 亚洲精品aⅴ在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 在线观看免费日韩欧美大片| 高清不卡的av网站| 天天影视国产精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产成人精品福利久久| 十分钟在线观看高清视频www| 成年人午夜在线观看视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩av不卡免费在线播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产毛片在线视频| 国产成人91sexporn| 国产片特级美女逼逼视频| 赤兔流量卡办理| 国产精品偷伦视频观看了| 日本爱情动作片www.在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品av久久久久免费| xxx大片免费视频| 免费黄色在线免费观看| 啦啦啦 在线观看视频| 日本vs欧美在线观看视频| 婷婷色综合www| 精品视频人人做人人爽| 街头女战士在线观看网站| 午夜福利视频精品| 性色av一级| 久久亚洲国产成人精品v| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久鲁丝午夜福利片| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 涩涩av久久男人的天堂| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一区二区av电影网| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久人人97超碰香蕉20202| 精品酒店卫生间| 久久这里只有精品19| 午夜福利视频精品| 午夜福利视频在线观看免费| 满18在线观看网站| 一边亲一边摸免费视频| 热99国产精品久久久久久7| 美女主播在线视频| 国产片内射在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区| 日韩电影二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 性少妇av在线| 久久青草综合色| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 免费观看av网站的网址| 精品久久久久久电影网| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 一级黄片播放器| 国产淫语在线视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 精品国产乱码久久久久久小说| 久久青草综合色| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲成人国产一区在线观看 | 男人操女人黄网站| 午夜免费鲁丝| 老汉色∧v一级毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 一区在线观看完整版| 国精品久久久久久国模美| 久久久久久久国产电影| www.av在线官网国产| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜福利视频精品| 欧美激情 高清一区二区三区| 少妇人妻 视频| 下体分泌物呈黄色| 五月开心婷婷网| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品 国内视频| 男男h啪啪无遮挡| 欧美av亚洲av综合av国产av | 男人舔女人的私密视频| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美人与善性xxx| 日韩大片免费观看网站| 亚洲专区中文字幕在线 | 高清不卡的av网站| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线天堂中文资源库| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 18禁观看日本| 最近中文字幕2019免费版| 色吧在线观看| 老司机影院成人| avwww免费| 久久久久久久久久久久大奶| 久久ye,这里只有精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 黄片无遮挡物在线观看| 日本av手机在线免费观看| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久久久久久久久免费av| e午夜精品久久久久久久| 老司机亚洲免费影院| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品 国内视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 美女午夜性视频免费| 18在线观看网站| 国产高清国产精品国产三级| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产99久久九九免费精品| 亚洲熟女毛片儿| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲综合色网址| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜福利一区二区在线看| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在线天堂中文资源库| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| a级毛片在线看网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 18禁观看日本| 精品酒店卫生间| 国产精品人妻久久久影院| 一本大道久久a久久精品| 精品视频人人做人人爽| 麻豆av在线久日| 午夜激情久久久久久久| 在线 av 中文字幕| 考比视频在线观看| 香蕉国产在线看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 丁香六月天网| a级毛片在线看网站| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲,欧美,日韩| bbb黄色大片| 国产精品久久久久成人av| 久久人人爽人人片av| 国产高清不卡午夜福利| 夫妻午夜视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产激情久久老熟女| 丝袜在线中文字幕| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | av网站在线播放免费| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产精品久久久人人做人人爽| 伊人亚洲综合成人网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产乱来视频区| 伦理电影大哥的女人| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 我要看黄色一级片免费的| 成年动漫av网址| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 黄频高清免费视频| 91国产中文字幕| 久久热在线av| 一区二区三区激情视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产成人91sexporn| 久久久久网色| 日韩一区二区视频免费看| 电影成人av| 日本av手机在线免费观看| videos熟女内射| 国产精品 国内视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| a级毛片在线看网站| 精品国产一区二区久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 成人午夜精彩视频在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品一区蜜桃| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产精品国产三级国产专区5o| 黄色一级大片看看| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 精品福利永久在线观看| 天美传媒精品一区二区| 美女午夜性视频免费| 老司机影院毛片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲欧美色中文字幕在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 中文欧美无线码| 色播在线永久视频| 美女视频免费永久观看网站| 国产有黄有色有爽视频| 夫妻午夜视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲男人天堂网一区| 日韩伦理黄色片| 2021少妇久久久久久久久久久| 午夜福利一区二区在线看| 久久精品亚洲av国产电影网| 91老司机精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 色94色欧美一区二区| 国产麻豆69| 最近手机中文字幕大全| h视频一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| av网站在线播放免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 免费av中文字幕在线| 日韩一区二区三区影片| 久久亚洲国产成人精品v| 视频区图区小说| 高清欧美精品videossex| 两个人免费观看高清视频| 国产精品一国产av| 我要看黄色一级片免费的| 欧美人与善性xxx| 中国三级夫妇交换| 999精品在线视频| 国产免费现黄频在线看| 在线观看三级黄色| 少妇 在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日日撸夜夜添| 亚洲五月色婷婷综合| 老司机影院毛片| 久久久久久久久免费视频了| 国产又爽黄色视频| 免费观看a级毛片全部| 天美传媒精品一区二区| 国产免费又黄又爽又色| 中文欧美无线码| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲在久久综合| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美成人午夜精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产一区二区 视频在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久人人爽人人片av| 看十八女毛片水多多多| 精品一区在线观看国产| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久亚洲精品成人影院| 美女福利国产在线| 久久狼人影院| e午夜精品久久久久久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 两个人看的免费小视频| 国产野战对白在线观看| 午夜日本视频在线| 久久精品国产综合久久久| 美女午夜性视频免费| 日本av免费视频播放| 热99国产精品久久久久久7| 欧美日本中文国产一区发布| 777米奇影视久久| 国产精品蜜桃在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 人妻人人澡人人爽人人| 男女床上黄色一级片免费看| 狂野欧美激情性xxxx| 999精品在线视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久这里只有精品19| 国产日韩欧美视频二区| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产中文字幕在线视频| 在线观看一区二区三区激情| 欧美日韩一级在线毛片| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 搡老乐熟女国产| 精品国产一区二区三区四区第35| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 免费看av在线观看网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久久久久免费视频了| 日韩电影二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美精品亚洲一区二区| 黑丝袜美女国产一区| 搡老乐熟女国产| tube8黄色片| 欧美日韩一级在线毛片| 另类精品久久| 一级,二级,三级黄色视频| 99久久综合免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久ye,这里只有精品| 久久久亚洲精品成人影院| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜免费鲁丝| 国产成人系列免费观看| bbb黄色大片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲精品日韩在线中文字幕| a级毛片黄视频| 免费观看av网站的网址| 日日爽夜夜爽网站| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲欧洲国产日韩| 韩国高清视频一区二区三区| 大话2 男鬼变身卡| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲久久久国产精品| 丰满乱子伦码专区| 国产乱人偷精品视频| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩精品有码人妻一区| 国产xxxxx性猛交| 国产成人啪精品午夜网站| 精品一品国产午夜福利视频| www.熟女人妻精品国产| 亚洲国产日韩一区二区| 高清欧美精品videossex| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品在线美女| 免费不卡黄色视频| 午夜福利一区二区在线看| 日本爱情动作片www.在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产极品天堂在线| 国产爽快片一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 婷婷色麻豆天堂久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产成人欧美在线观看 | 制服丝袜香蕉在线| 99热全是精品| 又大又黄又爽视频免费| 国产又爽黄色视频| 国产成人av激情在线播放| 免费高清在线观看日韩| 国产精品99久久99久久久不卡 | av在线app专区| 国产精品三级大全| 黄色一级大片看看| 国产片特级美女逼逼视频| 成人手机av| 亚洲av在线观看美女高潮| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 热re99久久国产66热| 成人毛片60女人毛片免费| 超碰97精品在线观看| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| av卡一久久| 精品福利永久在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产毛片在线视频| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲人成电影观看| 亚洲少妇的诱惑av| av天堂久久9| 午夜福利在线免费观看网站| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩不卡一区二区三区视频在线| avwww免费| av国产精品久久久久影院| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 飞空精品影院首页| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 男女床上黄色一级片免费看| 我要看黄色一级片免费的| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 超碰97精品在线观看| 午夜老司机福利片| 欧美97在线视频| 精品一区在线观看国产| 看十八女毛片水多多多| 老司机影院成人| 国产极品天堂在线| 九九爱精品视频在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 黄片小视频在线播放| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 哪个播放器可以免费观看大片| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲av福利一区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久99热这里只频精品6学生| av.在线天堂| 国产精品免费视频内射| 99香蕉大伊视频| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲国产中文字幕在线视频| 岛国毛片在线播放| 国产av国产精品国产| 亚洲精品美女久久av网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲中文av在线| 精品一区二区三区av网在线观看 | 天天影视国产精品| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜影院在线不卡| 中文字幕最新亚洲高清| 色网站视频免费| 国产 精品1| 日本午夜av视频| 97在线人人人人妻| 在线观看三级黄色| 午夜福利,免费看| 嫩草影院入口| 亚洲一区二区三区欧美精品| 999久久久国产精品视频| 亚洲av福利一区| 国产一区二区三区综合在线观看| 午夜免费鲁丝| 51午夜福利影视在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品一区二区三卡| 亚洲情色 制服丝袜| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲欧美一区二区三区久久| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品久久久久久久久免| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美黄色片欧美黄色片| 美女福利国产在线| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 青春草国产在线视频| 日日撸夜夜添| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 午夜日韩欧美国产| 麻豆av在线久日| 韩国精品一区二区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 女人久久www免费人成看片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人手机av| 丝袜喷水一区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产熟女欧美一区二区| av不卡在线播放| 久久性视频一级片| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 91精品国产国语对白视频| 18在线观看网站| 天天影视国产精品| 男男h啪啪无遮挡| 国产黄频视频在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 色播在线永久视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 青春草视频在线免费观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品成人在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品一区二区三区av网在线观看 | 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久国产欧美日韩av|