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    噬菌體展示系統(tǒng)篩選糖尿病相關(guān)抗原蛋白及應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

    2019-12-23 08:04:30劉堯林駿梁永羿山云王洪濤徐良
    關(guān)鍵詞:表位噬菌體抗原

    劉堯,林駿,梁永羿,山云,王洪濤,徐良

    論著

    噬菌體展示系統(tǒng)篩選糖尿病相關(guān)抗原蛋白及應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

    劉堯,林駿,梁永羿,山云,王洪濤,徐良

    用噬菌體展示系統(tǒng)篩選與糖尿病相關(guān)的自身抗原新表位,表達(dá)新抗原肽段并評(píng)價(jià)其在糖尿病診斷中的應(yīng)用效果。

    以 I 型糖尿病血清作為靶分子,對(duì) Ph.D.-12 噬菌體肽庫(kù)進(jìn)行淘選,測(cè)序淘選的噬菌體并用 ELISA 檢測(cè)噬菌體與靶分子的結(jié)合效果,BLAST 分析特異性最好的表位與糖尿病的相關(guān)性,選擇合適的目的基因合成重組質(zhì)粒,用 Expi 293 細(xì)胞表達(dá)新抗原肽段并檢測(cè)該抗原與臨床血清的特異結(jié)合效果。

    共完成 2418 個(gè)噬菌體單克隆的測(cè)序,淘選出 93 種表位序列,11 種具有代表性的表位中測(cè)序超過(guò) 200 次的有 4 種,對(duì)特異性最強(qiáng)的表位序列“-GTFLFSLCAAVY”進(jìn)行分析后選擇 mTOR 相關(guān)蛋白 mEAK-7 作為目的基因,抗原肽段與臨床血清的特異性結(jié)合效果為:I型糖尿病陽(yáng)性率為 17%,II型糖尿病陽(yáng)性率為 4%。

    mEAK-7 蛋白對(duì)糖尿病血清具有一定的抗原特異性,該基因與糖尿病可能有相關(guān)性,具有很好的研究?jī)r(jià)值。

    噬菌體展示系統(tǒng); 糖尿??; 自身抗體; 抗原表位

    I 型糖尿病是由于自身免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤攻擊和損傷胰島β 細(xì)胞,使胰島素合成和分泌減少或者完全缺失的自身免疫性疾病,臨床上大多數(shù) I 型糖尿病患者可被檢測(cè)到胰島自身抗體,目前來(lái)說(shuō),GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA2A 這 5 種胰島自身抗體是 I 型糖尿病檢測(cè)應(yīng)用最廣泛、最受認(rèn)可、相關(guān)性最強(qiáng)的自身免疫標(biāo)志物[1-2]。本研究通過(guò)噬菌體展示系統(tǒng)獲得與糖尿病相關(guān)的自身抗原新表位的氨基酸序列進(jìn)行自身抗原肽段的表達(dá),評(píng)估包含抗原表位在內(nèi)人工構(gòu)建的蛋白多肽對(duì)于糖尿病診斷的臨床價(jià)值和意義。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

    噬菌體展示試劑盒和ER 2738 購(gòu)自 Biolab 公司;培養(yǎng)基組分、Xgal、IPTG 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司;抗-M13 抗體(HRP)購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司;限制性?xún)?nèi)切酶和Expi 293 真核表達(dá)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒和蛋白電泳試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;ELISA 板購(gòu)自美國(guó)康寧公司;TMB 單組分顯色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;糖尿病抗體檢測(cè)試劑盒、全自動(dòng)免疫印跡分析儀購(gòu)自深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司;菌株DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存;其他化學(xué)試劑為分析純以上等級(jí)。

    1.2 方法

    1.2.1 噬菌體展示系統(tǒng)的淘選方法 分別收集來(lái)自健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者的血清,并將健康人,I 型糖尿病血清包被于 96 孔板中,150 μl/孔。TBST 溶液洗板 6 次,添加封阻液封阻,取 100 μl 原始噬菌體文庫(kù)(2 × 1011PFU)添加到包被有健康人血清的孔里,室溫作用 1 h,回收未結(jié)合的噬菌體液。將回收的噬菌體液添加到包被I型糖尿病血清的孔里,室溫作用 1 h,TBST 洗板 10 次,用洗脫液洗脫與I型糖尿病血清特異性結(jié)合的噬菌體。將特異性噬菌體感染至大腸桿菌 ER 2738 中擴(kuò)增 4.5 h,離心,取上清,用 PEG/NaCl 4 ℃沉淀過(guò)夜。次日將沉淀物離心,棄上清,將沉淀物溶于 TBST 溶液中,此即擴(kuò)增的噬菌體。將淘選后的噬菌體進(jìn)行滴度測(cè)定、擴(kuò)增,進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)淘選。每一輪進(jìn)行 4 個(gè)循環(huán)淘選,一共進(jìn)行4 輪淘選。

    1.2.2 測(cè)序淘選的噬菌體 取每個(gè)循環(huán)淘選后未擴(kuò)增的噬菌體液 5 μl 感染至大腸桿菌 ER 2738 并涂于含有四環(huán)素的 LB 培養(yǎng)皿上,37 ℃孵育過(guò)夜,隨機(jī)挑取 160 個(gè)單克隆噬菌斑,擴(kuò)增后將單克隆噬菌體送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。剩余噬菌體液保存于 4 ℃用于后續(xù) ELISA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn),或者用滅菌甘油 1:1 稀釋后,–20 ℃貯存。

    1.2.3 ELISA 檢測(cè)噬菌體對(duì)靶分子的特異性 對(duì)所有序列的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,將測(cè)序頻次高于 200 的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增并滴定。準(zhǔn)備兩個(gè)96 孔微孔板,每個(gè)待鑒定克隆分別在每個(gè)板上對(duì)應(yīng)一列孔(12 個(gè)孔)。板 1 用于包被 I 型糖尿病血清后進(jìn)行 ELISA 檢測(cè)所選序列與靶分子的結(jié)合力;板 2 僅用封阻液封阻后作為空白對(duì)照用于檢測(cè)所選序列對(duì) BSA 包被塑料板的結(jié)合力。將 1 × 1012PFU 的噬菌體進(jìn)行 5 倍系列梯度稀釋至第 12 孔,濃度分別為:1 × 1012、2 × 1011、4 × 1010、8 × 109、1.6 × 109、3.2 × 108、6.4×107、1.28 × 107、2.56 × 106、5 × 105、1 × 105和 2 × 104PFU,用多通道移液器將稀釋好的噬菌體吸取 100 μl 加入包被有靶分子的板 1 的對(duì)應(yīng)孔中,再吸取 100 μl加入板 2 的對(duì)應(yīng)孔中,每個(gè)濃度梯度做 3 個(gè)重復(fù)。室溫振蕩作用 1 h,洗板 6 次,添加稀釋后的抗-M13 抗體(HRP 標(biāo)記),200 μl/孔,室溫作用1 h,洗板 6 次后每孔加入 200 μl 底物溶液,室溫作用 20 min,酶標(biāo)儀檢測(cè) 405 nm 處的吸光度。

    1.2.4 分析表位序列與糖尿病的相關(guān)性 將上述驗(yàn)證特異性最好的表位序列導(dǎo)入 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 分析,查找與該表位序列具有同源關(guān)系的人源的氨基酸或蛋白片段,分析其與糖尿病、胰島 β 細(xì)胞或者相關(guān)疾病的關(guān)系,定位與糖尿病自身抗體相關(guān)的抗原表位。

    1.2.5 重組蛋白表達(dá) 選擇與糖尿病相關(guān)性最大的基因,設(shè)計(jì)與之對(duì)應(yīng)的核苷酸編碼序列,以定位的抗原表位為中心向該基因上下游分別延伸約200 個(gè)堿基作為目的基因,選取pcDNA 3.1 作為真核表達(dá)載體,合成重組質(zhì)粒。將合成的重組質(zhì)粒酶切并電泳鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng),抽提無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染進(jìn) Expi 293 細(xì)胞中進(jìn)行重組蛋白的表達(dá),收集表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)液,電泳檢測(cè)表達(dá)效果。

    1.2.6 ELISA 檢測(cè)重組蛋白的抗原特異性 將純化的重組蛋白稀釋至 1 μg/ml,添加到 96 孔板中,100 μl/孔,在 4 ℃包被過(guò)夜;PBST 溶液洗板 3 次,加入封阻液封阻,用樣品稀釋液分別將健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者的血清稀釋 100 倍,添加到 96 孔板中,每個(gè)樣本一個(gè)孔,室溫孵育 30 min,洗板 3 次,添加稀釋后的 HRP 標(biāo)記的兔抗人 IgG,100 μl/孔,室溫作用 30 min,洗板 3 次后每孔加入 100 μl 的 TMB 顯色液,室溫孵育 15 min,每孔加入100 μl 終止液,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔 450 nm 吸光度。

    1.2.7 與其他糖尿病自身抗體對(duì)比 用糖尿病抗體檢測(cè)試劑盒和全自動(dòng)免疫印跡分析儀分別對(duì)健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者的血清進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì) GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA2A 的陽(yáng)性率。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析及作圖,多組差異比較采用單因素方差分析,以< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 淘選的表位序列測(cè)序結(jié)果

    本實(shí)驗(yàn)每輪淘選出 640 個(gè)單克隆噬菌體(表 1),經(jīng)過(guò) 4 輪淘選的送測(cè)序樣本共計(jì) 2560 個(gè),最終獲得有效測(cè)序樣本共計(jì) 2418 個(gè),占總樣本的 94.4%,共淘選出 128 種表位序列,其中 15 種表位序列出現(xiàn)的頻次較高,具有一定代表性。排除各輪之間 35 種重復(fù)序列后得到特異表位序列 93 種,排除各輪之間 4 種重復(fù)代表性表位序列后得到代表性特異表位序列 11 種,代表性特異表位序列樣本數(shù)為 1620 個(gè)(表 2),占有效測(cè)序樣本的 67%。

    表 1 淘選的表位序列結(jié)果

    表 2 具有代表性的特異表位序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    2.2 ELISA 檢測(cè)噬菌體對(duì)靶分子的特異性

    ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示同一種噬菌體在濃度為 1 × 1012、2 × 1011和 4 × 1010PFU 時(shí)檢測(cè)值差異較小,但 P12-3 在各個(gè)濃度梯度的檢測(cè)值都與其他噬菌體差異較大(< 0.0001),比其他幾個(gè)噬菌體的檢測(cè)值高至少 3 倍。雖然 P12-1 和 P12-2 出現(xiàn)的頻次高于 P12-3,但是 P12-3 的特異性明顯強(qiáng)于其他幾種噬菌體,特異性由強(qiáng)到弱分別是:P12-3 > P12-2 > P12-1 > P12-4(圖 1A)。P12-1、P12-2 和 P12-4 只有在濃度大于 8 × 109PFU 時(shí)才有明顯的檢測(cè)效果,而 P12-3 在濃度介于 2.56 × 106~4 × 1010PFU 之間的檢測(cè)結(jié)果有良好的線性關(guān)系(y = 3E + 09x2– 4E + 09x + 6E + 08,2= 0.9984)(圖 1B)。

    2.3 BLAST 分析多肽序列

    將特異性最高 P12-3 的表位序列“-GTFLFSLCAAVY”導(dǎo)入 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST分析,與該序列具有同源性的人源基因共有 60 個(gè)序列,統(tǒng)計(jì)后獲得 5 個(gè)與該序列具有較高同源性的人源基因(表 3)。

    2.4 重組質(zhì)粒及真核表達(dá)的目的蛋白的鑒定

    通過(guò)分析,選取與“-GTFLFSLCAAVY”同源性最高的 mTOR 相關(guān)蛋白 mEAK-7 作為目的基因并合成重組質(zhì)粒,合成 DNA 分子量約為 480 bp(圖 2A),經(jīng)過(guò)真核細(xì)胞 Expi293 表達(dá),重組的 mEAK-7 分子量約為 18 kD,符合預(yù)期重組蛋白的分子量大?。▓D 2B)。

    2.5 ELISA 檢測(cè)表達(dá)的重組蛋白的抗原特異性

    將純化后的重組蛋白作為抗原包被在 96 孔板上,用 ELISA 方法檢測(cè)健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病血清(各 200 例)與重組蛋白的特異性反應(yīng),結(jié)果顯示,健康人樣本均呈現(xiàn)陰性結(jié)果,I 型糖尿病樣本有 34 個(gè)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,陽(yáng)性率為 17%,II 型糖尿病樣本有 8 個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,陽(yáng)性檢出率為 4%,說(shuō)明 mEAK-7 蛋白對(duì)于糖尿病患者血清具有一定的特異性(圖3)。

    圖 1 噬菌體與靶分子的特異性檢測(cè)(A:ELISA檢測(cè)不同表位的噬菌體在不同濃度條件下與靶分子的特異性識(shí)別;n = 3,*P < 0.0001;B:ELISA分析P12-3的檢測(cè)線性范圍)

    Figure 1 Specific identification of phage and target molecules (A: Specific identification of target molecules and different epitopes at different concentrations by ELISA; n = 3,*< 0.0001; B: Linear range of ELISA analysis for P12-3)

    表 3 表位序列同源性分析結(jié)果

    1:?jiǎn)蚊盖校?:雙酶切;3:對(duì)照;4:mEAK-7;M:Marker

    Figure 2 Identification of recombinant plasmids and recombinant proteins (A: Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant plasmids; B: SDS-PAGE analysis of recombinant protein)

    圖 3 ELISA 檢測(cè)重組蛋白與臨床血清的結(jié)合效果

    Figure 3 Identification of the binding effect of recombinant protein and clinical serum by ELISA

    2.6 免疫印跡法檢測(cè)其他糖尿病自身抗體陽(yáng)性率

    用免疫印跡法對(duì)健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者血清(各 200 例)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示I 型糖尿病患者血清中 GADA 和 ZnT-8A 陽(yáng)性率較高(表 4),分別為 61.5% 和 52%,ICA、IAA、IA-2A 的陽(yáng)性率介于 17% ~ 20%,與 mEAK-7 的陽(yáng)性檢出結(jié)果近似;II 型糖尿病患者血清的 GADA陽(yáng)性率也是最高的,達(dá)到 17.5%,ZnT-8A、ICA、IAA、IA-2A 的陽(yáng)性率均小于 10%,而 ICA 和 IA-2A 的陽(yáng)性率分別為 4.5% 和 4%,與 mEAK-7 的陽(yáng)性檢出結(jié)果類(lèi)似。

    表 4 GADA、ICA、IAA、ZnT-8A、IA-2A 的陽(yáng)性率檢測(cè)

    3 討論

    mTOR 信號(hào)通路在生物體內(nèi)眾多細(xì)胞信號(hào)通路中占據(jù)相當(dāng)重要的地位,參與調(diào)控如增殖、生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生命現(xiàn)象,同時(shí)在炎癥、腫瘤、代謝和心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道 mTOR 信號(hào)通路與胰島素和糖代謝相關(guān),在長(zhǎng)期高濃度的葡萄糖刺激下,信號(hào)通路 Insulin/PI3K/PKB 下游的 mTOR/S6K1 處于激活狀態(tài),過(guò)度表達(dá)而抑制胰島素的信號(hào)傳導(dǎo),從而引起胰島素抵抗[3-4]。目前關(guān)于 mEAK-7 相關(guān)功能的研究報(bào)道很少,也沒(méi)有文獻(xiàn)提出其與糖尿病相關(guān),但有報(bào)道提出 mEAK-7 能夠?qū)?mTOR 招募到溶酶體中與其相互作用,通過(guò) S6K2 和 4E-BP1 激活另一種 mTOR 信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移[5]。因此,mEAK-7 有可能通過(guò)調(diào)節(jié) mTOR 信號(hào)通路而調(diào)節(jié)胰島素分泌。

    噬菌體展示技術(shù)成為探測(cè)蛋白空間結(jié)構(gòu)、探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋找高親和力和生物活性的配體分子的有利工具,噬菌體展示技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、食品、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域[6-9]。本研究應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)最終篩選出的特異性最高的抗原表位“-GTFLFSLCAAVY”,且 ELISA 實(shí)驗(yàn)證明真核表達(dá)的 mEAK-7 蛋白能夠與糖尿病血清中的靶分子有一定的特異結(jié)合效果。與目前廣泛認(rèn)可的糖尿病自身抗體GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA-2A 陽(yáng)性率對(duì)比,mEAK-7 在 I 型糖尿病中的陽(yáng)性率接近于ICA、IAA、IA-2A 的陽(yáng)性率,在 II 型糖尿病中的陽(yáng)性率接近于 ICA、IA-2A 的陽(yáng)性率,因此mEAK-7 對(duì)糖尿病自身抗體的檢測(cè)具有一定的輔助作用,為深入研究糖尿病自身抗原抗體提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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    Screening of diabetes-associated antigen protein by phage display system and evaluation of its application effect

    LIU Yao, LIN Jun, LIANG Yong-Yi, SHAN Yun, WANG Hong-tao, XU Liang

    We aim to screen a novel epitope of antigen associated with diabetes by phage display system, andexpress new antigenic peptides and evaluate its potential application in the diagnosis of diabetes.

    Type 1 diabetes patients serum were used for the panning of the Ph.D.-12 phage display library, and the selected phases were sequenced and the binding effect of the phage on the target molecule was detected by ELISA. The correlation between the best specific epitope and diabetes was analyzed by BLAST, and appropriate target gene was selected to construct recombinant plasmid. The new antigen peptide was expressed in Expi 293 cells and detected for specific binding effect on clinical serum.

    A total of 2418 phage monoclonal sequences were sequenced, and 93 epitope sequences were selected, from which 4 of the 11 representative epitopes were sequenced more than 200 times. The best specific epitope sequence was identified as “-GTFLFSLCAAVY”. After analysis, mTOR-associated protein mEAK-7 was selected as a target gene, and the positive rate for the specific binding effect of the antigen peptide on clinical serum was 17% and 4% in type I and II diabetic serum, respectively.

    mEAK-7 protein may have specific binding effect on diabetic serum. This gene may be related to diabetes and has good research value.

    Phage display system; Diabetes; Autoantibody; Antigen epitope

    XU Liang, Email: xuliang@szda.gov.cn

    Author Affiliations:In-vitro Diagnostic Reagents Testing Department, Shenzhen Institute for Drug Control/Shenzhen Testing Center of Medical Devices, Gungdong 518057, China

    10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.007

    廣東省食品藥品監(jiān)督管理局科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2018ZDB14);深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20170307090049352)

    518057 深圳市藥品檢驗(yàn)研究院/深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心體外診斷試劑部

    徐良,Email:xuliang@szda.gov.cn

    2019-09-09

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