胞紅蛋白對巨噬細胞氧化損傷的保護作用

,，， ，，，，

(1.南華大學醫(yī)學院病生教研室，心血管病研究所，動脈硬化學湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第一醫(yī)院；3.南華大學附屬第二醫(yī)院急診科)

·基礎醫(yī)學·

胞紅蛋白對巨噬細胞氧化損傷的保護作用

屈順林1,朱宇凝1，潘文軍1，李維1，王宇菲1，謝黎明2，姜志勝1，范文靜3

(1.南華大學醫(yī)學院病生教研室，心血管病研究所，動脈硬化學湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第一醫(yī)院；3.南華大學附屬第二醫(yī)院急診科)

目的探討CYGB在巨噬細胞氧化損傷過程中的表達及作用。方法構建CYGB高表達/低表達巨噬細胞模型，Western blot檢測不同濃度H2O2刺激RAW264.7 12 h后CYGB的蛋白表達水平；用分光光度計觀察RAW264.7在氧化損傷過程中乳酸脫氫酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量的變化情況。結果0.5 mmol/L H2O2處理巨噬細胞12 h后CYGB表達水平明顯高于空白對照組(P<0.05)；與0.5 mmol/L H2O2處理組相比，0.5 mmol/L H2O2對CYGB高表達組的CYGB表達升高(P<0.05)，而0.5 mmol/L H2O2對CYGB低表達組的CYGB表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；0.5 mmol/L H2O2+CYGB高表達組中LDH活性和MDA含量下降；0.5 mmol/L H2O2+CYGB低表達組中LDH活性和MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論巨噬細胞氧化損傷時CYGB表達水平增加；CYGB在巨噬細胞氧化損傷過程中具有拮抗作用。

巨噬細胞； 氧化應激； 胞紅蛋白； 過氧化氫

氧化應激是指體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧 (reactive oxygen species，ROS)分子，細胞內(nèi)氧化/抗氧化防御機制的平衡被打破，ROS及其相關代謝產(chǎn)物過量聚集，導致細胞損傷[1]。而巨噬細胞可以吞噬、殺傷和清除細菌、病毒及損傷、衰老的組織細胞有助于病變部位的康復[2]。 珠蛋白廣泛存在于動植物中，具有獨特的蛋白結構—血紅素輔基，其可以通過鐵卟啉環(huán)和組氨酸多肽鏈與氧分子可逆性結合[3]，在呼吸系統(tǒng)中尤為重要。在脊椎動物中，已知的珠蛋白主要有肌紅蛋白(MGB)、血紅蛋白(HGB)、腦紅蛋白(NGB)和胞紅蛋白(CYGB)[4]。而CYGB具有攜氧與貯氧、氧感受器等生理功能[5]，同時它還具有清除自由基的作用[6-7]。然而CYGB在巨噬細胞氧化應激時的作用尚不清楚。

1 材料與方法

1.1材料與試劑小鼠巨噬細胞RAW264.7購于中南大學湘雅醫(yī)學院中心實驗室；硝酸纖維素膜(PVDF)為Millipore公司產(chǎn)品。 BCA Protein Assay Kit為Pierce公司產(chǎn)品，；ECL發(fā)光檢測試劑盒購于康為公司。CYGB抗鼠一抗購于 Proteintech 公司；β-actin一抗購于長沙艾佳生物技術有限公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒和丙二醛(MDA)檢測試劑盒均購于南京建成公司； DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司。

1.2細胞培養(yǎng)及分組

1.2.1 RAW264.7細胞用含10%的小牛血清并含10 mmol/l的HEPES的DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁達70%～90%時進行傳代。傳代時棄去培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后，加入5 mL含血清培養(yǎng)液終止消化，每24～72 h傳代一次。

1.2.2 實驗分組 探討CYGB表達水平改變對RAW264.7 氧化損傷的作用，將RAW264.7細胞分為四組：①對照組；② 0.5 mmol/L H2O2處理RAW264.7 12 h組；③ 0.5 mmol/L H2O2+CYGB高表達組：先轉染CYGB表達質粒，24 h后用0.5 mmol/L H2O2處理RAW264.7 12 h；④ 0.5 mmol/L H2O2+CYGB低表達組：先轉染CYGB干擾質粒，24 h后用0.5 mmol/L H2O2處理RAW264.7 12 h。

1.3蛋白印跡(Western blot) 用裂解液裂解各組細胞，提取總蛋白。利用蛋白定量試劑盒定量后，100 ℃煮3～5 min使蛋白變性，分裝并于-80 ℃保存。配制并灌注10%SDS-PAGE分離膠和5%的濃縮膠，加入蛋白樣品，恒壓80 V電泳30 min，待溴酚藍染料帶進入分離膠后將電流調(diào)至120 V電泳1 h，轉膜到PVBDF膜上，恒流200 mA轉膜2 h；5%無抗脫脂奶粉封閉4 h，加一抗于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，然后將辣根過氧化物酶標記的相應二抗與膜共同孵育1 h，TBST洗膜3次，室溫搖蕩洗膜，每次10 min，顯影，定影。

1.4 CYGB表達和低表達巨噬細胞模型的構建

1.4.1 參考分子克隆CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細胞，加入本課題組已有的質粒進行轉化對菌液進行質粒的提取，然后用于轉染[8]。

1.4.2 轉染細胞 轉染前一天進行細胞鋪板，使用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，使轉染時細胞密度達到30%～50%。

1.5 LDH活性及MDA含量檢測將準備好的細胞樣本采用南京建成生物工程研究所相應試劑盒，操作步驟嚴格參照試劑盒說明書執(zhí)行，分光光度計檢測MDA及LDH含量。

2 結 果

2.1 H2O2處理對RAW264.7細胞CYGB表達的影響

熒光定量PCR和Western blot檢測結果發(fā)現(xiàn)用0.5 mmol/L H2O2處理巨噬細胞12 h后CYGB表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與H2O2處理組相比，0.5 mmol/L H2O2+CYGB高表達組的CYGB表達顯著增加，0.5 mmol/L H2O2+CYGB低表達組的CYGB表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 CYGB對RAW264.7細胞LDH活性影響H2O2刺激能明顯上調(diào)LDH的活性，轉染CYGB表達質粒能下調(diào)LDH活性，而轉染CYGB干擾質粒卻上調(diào)LDH活性。

組別H2O2(μmol/L)LDH(U/mg·prot)control組022．52±1．158H2O2處理組50052．70±1．716aH2O2+CYGB高表達組50044．91±0．925bH2O2+CYGB低表達組50060．25±0．543b

與對照組比較,a:P<0.05;與H2O2處理組比較,b:P<0.05

2.3 CYGB對RAW264.7細胞MDA含量影響H2O2刺激能明顯上調(diào)MDA的含量，轉染CYGB表達質粒能下調(diào)MDA含量，而轉染CYGB干擾質粒卻進一步上調(diào)MDA含量。

圖1 H2O2處理巨噬細胞對CYGB表達的影響 A:熒光定量PCR結果；B:Western blot檢測結果 與空白對照組比較,*:P<0.05；與H2O2處理組比較,#:P<0.05

圖2 CYGB對H2O2刺激巨噬細胞時LDH的影響 A：control組； B：H2O2組； C：H2O2+CYGB高表達組； D：H2O2+CYGB低表達組.與對照組比較,*P<0.05；與H2O2處理組比較,#P<0.05

表2CYGB對H2O2刺激巨噬細胞時MDA含量的影響(x±s，n=3)

組別H2O2(μmol/L)MDA(U/mg·prot)control組01．591±0．084H2O2處理組5002．142±0．062aH2O2+CYGB高表達組5001．944±0．041bH2O2+CYGB低表達組5002．358±0．069b

與對照組比較,a:P<0.05；與H2O2處理組比較,b:P<0.05

3 討 論

巨噬細胞作為免疫細胞在體內(nèi)扮演著清道夫角色，可聚集到病變部位。激活后的巨噬細胞能產(chǎn)生和釋放大量ROS，ROS過多介導的氧化應激反應可導致細胞功能下降，甚至細胞器損傷、溶解[9]。組織缺氧(如心肌梗死)也可造成細胞內(nèi)氧化應激，產(chǎn)生大量的活性氧，釋放到細胞外，導致組織細胞的進一步損傷[10]。氧化應激可引起多種促炎細胞因子的表達釋放促進細胞的活化，巨噬細胞活化后又可出現(xiàn)呼吸“爆發(fā)現(xiàn)象”[11]，產(chǎn)生大量的ROS，在氧自由基殺傷異物的同時大量的ROS也會造成細胞內(nèi)功能的下降，細胞器的溶解，細胞壞死等[12]。另外H2O2可使生物膜中的多不飽和脂肪酸氧化損傷，改變膜流動性、通透性和破壞膜的完整性，進而造成氧化應激損傷，在感染、缺血/再灌注損傷、休克等多種炎性疾病引起的病理性改變過程中氧化應激扮演著重要角色[13]。

圖3 CYGB對H2O2刺激巨噬細胞時MDA含量的影響 A：control組； B：H2O2組； C:H2O2+CYGB高表達組； D:H2O2+CYGB低表達組.*:P<0.05，與對照組比較；#:P<0.05，與H2O2處理組比較

當細胞受到各種刺激的時候，NF-κB二聚體釋放出來，然后經(jīng)過翻譯后的修飾作用后進一步被激活，并轉移到細胞核中，在細胞核中與目的基因結合并促進其轉錄[14]。CYGB在細胞核與細胞質中均有表達，在氧化損傷過程中，NF-κB與CYGB都被激活且表達增高[15]。CYGB啟動子區(qū)的CpG小島區(qū)域具有NF-κB結合位點，這意味著CYGB表達可能受到NF-κB的調(diào)控[16]。通過熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)，CYGB與NF-κB具有內(nèi)在的相關性，在巨噬細胞氧化應激過程中CYGB上調(diào)，NF-κB下降；而低表達CYGB后可使NF-κB上調(diào)。考慮可能是CYGB具有抗氧化、清除ROS的功能，在氧化應激反應中減少了ROS對細胞的損傷，降低了ROS對細胞的刺激，從而反射性的降低了NF-κB的表達[17]。本課題研究應用H2O2構建氧化損傷模型，以探討CYGB在H2O2誘導的RAW264.7細胞氧化應激損傷中的作用[18]。 CYGB具有儲存、運輸O2，結合和清除NO等功能。在細胞氧化應激過程中能夠表達上調(diào)，清除過多的ROS[19]。CYGB作為新發(fā)現(xiàn)的攜氧珠蛋白，在細胞氧化應激過程中表達上調(diào)，具有清除ROS的作用[9]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)CYGB在氧化應激過程中表達升高且對巨噬細胞的氧化損傷具有明顯的保護作用[20]。

CYGB作為珠蛋白家族成員，從發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有十余年。CYGB含有血紅素蛋白能夠結合O2，NO和CO[21]。CYGB參與了細胞多種生理過程的調(diào)控，包括細胞增殖與分化和氧化還原平衡等[22]。CYGB的功能研究有望對慢性炎癥性疾病的防治提供一個新的方向。

[1] Sugimoto H,Makino M,Sawai H,et al.Structural basis of human cytoglobin for ligand binding[J].J Mol Biol,2004,339(4):873-885.

[2] Kumar,S.,R.Meena and R.Paulraj,Role of Macrophage (M1 and M2) in Titanium-Dioxide Nanoparticle-Induced Oxidative Stress and Inflammatory Response in Rat[J].Appl Biochem Biotechnol,2016.

[3] Burmester T,Ebner B,Weich B,et al.Cytoglobin:a novel globin type ubiquitously expressed in vertebrate tissues[J].Mol Biol Evol,2002,19(4):416-421.

[4] 曾海燕,方勇,曾高峰.丹紅注射液對脂多糖誘導THP-1巨噬細胞促炎因子分泌的影響及機制[J].中南醫(yī)學科學雜志,2014,42(5):443-446.

[5] Yoshizato K,Thuy le TT,Shiota G,et al.Discovery of cytoglobin and its roles in physiology and pathology of hepatic stellate cells [J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci,2016,92(3):77-97.

[6] Hodges NJ,Innocent N,Dhanda S,et al.Cellular protection from oxidative DNA damage by over-expression of the novel globin cytoglobin in vitro[J].Mutagenesis,2008,23(4):293-298.

[7] Schmidt M,Gerlach F,Avivi A,et al.Cytoglobin is a respiratory protein in connective tissue and neurons,which is up-regulated by hypoxia[J].J Biol Chem,2004,279(9):8063-8069.

[8] Liu Q,Dai Z,Liu Z,et al.Oxidized low-density lipoprotein activates adipophilin through ERK1/2 signal pathway in RAW264.7 cells[J].Acta Biochim Biophys Sin,2010,42(9):635-645.

[9] De Beuf A,Hou XH,D’Haese PC,et al.Epoetin delta reduces oxidative stress in primary human renal tubular cells[J].J Biomed Biotechnol,2010,2010:395785.

[10] Li D,Chen XQ,Li WJ,et al.Cytoglobin up-regulated by hydrogen peroxide plays a protective role in oxidative stress[J].Neurochem Res,2007,32(8):1375-1380.

[11] Chua PJ,Yip GW,Bay BH.Cell cycle arrest induced by hydrogen peroxide is associated with modulation of oxidative stress related genes in breast cancer cells[J].Exp Biol Med (Maywood),2009,234(9):1086-1094.

[12] Chuang YC.Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in seizure-induced neuronal cell death[J].Acta Neurol Taiwan,2010,19(1):3-15.

[13] Guo X,Philipsen S,Tan-Un KC.Characterization of human cytoglobin gene promoter region[J].Biochim Biophys Acta,2006,1759(5):208-215.

[14] Nishi H,Inagi R,Kawada N,et al.Cytoglobin,a Novel Member of the Globin Family,Protects Kidney Fibroblasts against Oxidative Stress under Ischemic Conditions [J].Am J Pathol,2011,178(1):128-139.

[15] Wystub S,Ebner B,Fuchs C,et al.Interspecies comparison of neuroglobin,cytoglobin and myoglobin:sequence evolution and candidate regulatory elements[J].Cytogenet Genome Res,2004,105(1):65-78.

[16] Harris AL.Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth[J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):38-47.

[17] Denko NC.Hypoxia,HIF1 and glucose metabolism in the solid tumour[J].Nat Rev Cancer,2008,8(9):705-713.

[18] Guo X,Philipsen S,Tan-Un KC.Characterization of human cytoglobin gene promoter region[J].Biochim Biophys Acta,2006,1759(5):208-215.

[19] Fordel E,Thijs L,Moens L,et al.Neuroglobin and cytoglobin expression in mice.Evidence for a correlation with reactive oxygen species scavenging[J].FEBS J,2007,274(5):1312-1317.

[20] 潘文軍.胞紅蛋白對巨噬細胞氧化損傷的保護作用[D].南華大學醫(yī)學院心血管疾病研究所，2015:1-89.

[21] Chua PJ,Yip GW,Bay BH.Cell cycle arrest induced by hydrogen peroxide is associated with modulation of oxidative stress related genes in breast cancer cells[J].Exp Biol Med (Maywood),2009,234(9):1086-1094.

[22] Mimura I,Nangaku M,Nishi H,et al.Cytoglobin,a novel globin,plays an antifibrotic role in the kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,299(5):F1120-1133.

ProtectiveeffectofCYGBonMacrophageduringOxidativeDamage

QU Shunlin,ZHU Yuning,PAN Wenjun,et al
(DepartmentofPathophysiology,CollegeofMedicine,UniversityofSouthChinaHengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo observe change of cytoglobin(CYGB) expression and explore the protective role of CYGB during oxidative stress in macrophages.MethodsWestern blot was used to detect CYGB expression after 0.5 mmol/L H2O2treatment for 12 h.Cell model of CYGB overexpression and downexpression was constructed,then to observe the role of CYGB during oxidative stress.After treatment with H2O2for 12 h,CYGB protein levels,lactate dehydrogenase(LDH) and malondialdehyde(MDA) were detected in each group.ResultThe expression of CYGB in H2O2-treated group was increased compared with control group,the difference was significant (P<0.05).The expression of CYGB was higher in 0.5 mmol/L H2O2treatment+CYGB expression group and lower in 0.5 mmol/L H2O2treatment+CYGB interference group compared with the 0.5 mmol/L H2O2treated group (P<0.05).Results showed that LDH,MDA level was decreased in H2O2treatment+CYGB expression group and increased in H2O2treatment+CYGB interference group.ConclusionExpression of CYGB in macrophage was increased during oxidative stress.The CYGB protected against oxidative injury in macrophage.

macrophages; oxidative stress; cytoglobin; H2O2

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.002

2015-12-25；

2016-07-26

國家自然基金項目(編號:81670424)、國家安全生產(chǎn)重大事故防治關鍵技術科技項目(hunan-0013-2016AQ)、湖南省科技廳項目(編號：2015SK20203，2011TT2051)、湖南自然科學基金項目(編號：2015JJ2118)、湖南省教育廳重點課題(編號：2015JJ2118)、湖南省衛(wèi)計委科研項目(編號：B2016087)、湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2016B480)和中國博士點基金項目(編號：20114324120004)。.

*通訊作者，qushunlin78@126.com.

R36

A

秦旭平)