二甲雙胍聯(lián)合異羥肟酸對骨肉瘤細(xì)胞增殖凋亡的影響

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(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院脊柱外科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

二甲雙胍聯(lián)合異羥肟酸對骨肉瘤細(xì)胞增殖凋亡的影響

申瑩瑩1，蘇小桃2，歐軍2，何俊2*

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院脊柱外科)

目的研究二甲雙胍(Met)聯(lián)合異羥肟酸(SAHA)應(yīng)用對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖和凋亡的影響。

方法MTS法分別檢測二甲雙胍、SAHA和二甲雙胍聯(lián)合SAHA對MG-63細(xì)胞生長的抑制作用；平板克隆實驗檢測二甲雙胍聯(lián)合SAHA對MG-63細(xì)胞克隆形成能力的影響；流式細(xì)胞儀檢測二甲雙胍聯(lián)合SAHA對MG-63細(xì)胞凋亡的影響；Western Blot檢測聯(lián)合用藥后細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果二甲雙胍和SAHA分別對MG-63細(xì)胞生長有抑制作用，二甲雙胍聯(lián)合SAHA應(yīng)用對MG-63細(xì)胞生長的抑制作用更加顯著；二甲雙胍聯(lián)合SAHA應(yīng)用與單藥相比能夠明顯降低MG-63細(xì)胞克隆形成率，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡；聯(lián)合用藥后P27，P21，Cyclin D1，Mcl-1，XIAP，Bim，Cytochrome C蛋白發(fā)生明顯改變。結(jié)論二甲雙胍聯(lián)合SAHA應(yīng)用與單藥相比能夠顯著抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，可見兩藥聯(lián)用對腫瘤細(xì)胞的殺傷具有協(xié)同性。

二甲雙胍； 異羥肟酸； 骨肉瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年[1]，因此，長期的化療影響應(yīng)予以重視，目前迫切需要一些沒有或僅有較少累積毒性的治療藥物給骨肉瘤患者帶來福音。二甲雙胍(Metformin,Met)在臨床中用來降低2型糖尿病患者的血糖水平，然而近幾年因其潛在的抗腫瘤作用而引起了人們的極大注意[2-3]，其抗腫瘤效應(yīng)被認(rèn)為與其降血糖作用無關(guān)[4-5]。組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylase inhibitor，HDACi)是一類新型抗腫瘤藥物，對多種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤具有顯著抗腫瘤作用，而異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)則是其中一種非常有效的HDACi[6]。本研究的目的是評估二甲雙胍和SAHA在體外對人骨肉瘤細(xì)胞株的增殖和凋亡的影響，并評估其協(xié)同抗腫瘤作用，初步探討其聯(lián)合作用的機制，旨在為這種新型聯(lián)合化療模型的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料人骨肉瘤細(xì)胞株MG63購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Gibco公司，二甲雙胍、SAHA、姬姆薩染液購于Sigma-Aldrich公司，MTS購于Promega公司，Annexin V/PI試劑盒購于凱基生物公司，Western Blot一抗均購于santa cruz公司，二抗購于Pierce Biotechnology。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MG63細(xì)胞用RPMI1640+10%胎牛血清，培養(yǎng)液含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，于37 ℃，5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，實驗所用的細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2 MTS法測定細(xì)胞增殖 對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×103個細(xì)胞。設(shè)空白組(僅加培養(yǎng)液)、對照組和藥物系列組(單藥或同時聯(lián)合)，每組設(shè)3個重復(fù)孔，每孔容積為100 μL。需等細(xì)胞培養(yǎng)24 h足夠貼壁后才能進(jìn)行加藥處理，于處理72 h后終止培養(yǎng)。在終止培養(yǎng)前4 h，加MTS每20 μL/孔。用酶標(biāo)儀讀取 490 nm 處吸光度值(A值)。按下列公式計算細(xì)胞活力(Cell Viability)，細(xì)胞活力=(藥物處理組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。實驗重復(fù)3次。繪制Cell Viability vs 藥物濃度曲線。

1.2.3 克隆形成實驗 500個細(xì)胞種在6 cm培養(yǎng)皿中，貼壁后不同藥物處理，一周后培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆，培養(yǎng)終止。棄掉培養(yǎng)液，用PBS小心洗兩次。20 %甲醇5 mL固定15 min，棄去固定液，加適量姬姆薩染色40 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用克隆計數(shù)儀自動計數(shù)。

1.2.4 Annexin V/PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 細(xì)胞用不同藥物處理48 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞(上清中的細(xì)胞也要收集)；用PBS洗滌細(xì)胞二次(2 000 rpm離心5 min)收集(1～5)×105細(xì)胞；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上，左下象限顯示正常細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，取右上象限和右下象限的總和(即Annexin V陽性細(xì)胞群)計為凋亡細(xì)胞。

1.2.5 Western Blot 用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取其總蛋白或胞漿蛋白，在聚丙烯酰胺凝膠中電泳。將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗4 ℃孵育過夜；TBST漂洗后與二抗反應(yīng)，室溫孵育1 h；TBST 漂洗，10 min/次，洗滌3次；加入發(fā)光液后顯影、定影、拍照。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理用GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1二甲雙胍和SAHA單藥使用對MG-63細(xì)胞增殖的抑制二甲雙胍和SAHA單藥處理72 h后，不同的藥物濃度對MG-63細(xì)胞增殖的抑制作用見圖1。實驗結(jié)果顯示，MG-63的細(xì)胞活力隨著藥物濃度的逐漸增加而降低(二甲雙胍IC50=7.5 mmol/L,SAHA IC50=0.3 μmol/L)。單獨使用二甲雙胍或SAHA對骨肉瘤細(xì)胞MG-63的增殖均有抑制作用。

圖1 二甲雙胍和SAHA單藥對MG63細(xì)胞增殖的影響

2.2二甲雙胍聯(lián)合SAHA使用對MG-63細(xì)胞增殖的影響從實驗結(jié)果可以看到，單獨使用二甲雙胍或SAHA對細(xì)胞增殖起到了一定的抑制作用，但是當(dāng)使用1 mmol/L的二甲雙胍分別于 0.1 和 0.2 μmol/L的SAHA同時聯(lián)用時，細(xì)胞的增殖明顯受到了抑制，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單藥使用。聯(lián)合用藥組對細(xì)胞增殖的抑制作用與SAHA單藥組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

圖2 二甲雙胍和SAHA聯(lián)合對MG63細(xì)胞增殖的影響 1:control;2:二甲雙胍 1 mmol/L;3:SAHA 0.1 μmol/L;4:SAHA 0.2 μmol/L;5:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.1 μmol/L;6:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.2 μmol/L.與SAHA 0.1 μmol/L組比較，a:P<0.05;與SAHA 0.2 μmol/L組比較，b:P<0.001

2.3二甲雙胍聯(lián)合SAHA使用對MG-63細(xì)胞克隆形成的影響腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞克隆形成能力不僅體現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞群體依賴性，而且還反映細(xì)胞的長期增殖能力。實驗結(jié)果顯示，與單藥使用相比，兩藥聯(lián)合使用后細(xì)胞克隆形成率明顯下降，差異有顯著性，見圖3。二甲雙胍聯(lián)合SAHA(同時)與單藥相比能夠有效地抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63的克隆形成。

2.4二甲雙胍聯(lián)合SAHA使用對MG-63細(xì)胞凋亡的影響促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是藥物治療腫瘤的另一個重要切入點。藥物處理細(xì)胞48 h后，進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，單獨使用1 mmol/L二甲雙胍能夠使得MG-63細(xì)胞的凋亡率達(dá)到15.24%，單獨使用0.1 μmol/L或0.2 μmol/L SAHA能夠使得MG-63細(xì)胞的凋亡率分別達(dá)到25.32%和38.80%。當(dāng)使用1 mmol/L二甲雙胍分別聯(lián)合0.1 μmol/L和0.2 μmol/L SAHA處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率顯著增加，分別為46.17%和60.42%，與單藥使用相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。二甲雙胍和SAHA單獨使用可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但是兩藥同時聯(lián)用其促凋亡的能力更加明顯。

圖3 二甲雙胍和SAHA聯(lián)合對MG63細(xì)胞克隆形成的影響 1:Control;2:二甲雙胍 1 mmol/L;3:SAHA 0.1 μmol/L;4:SAHA 0.2 μmol/L;5:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.1 μmol/L;6:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.2 μmol/L.與SAHA 0.1 μmol/L組比較,a:P<0.001;與SAHA 0.2 μmol/L組比較,b:P<0.001

2.5二甲雙胍聯(lián)合SAHA對MG-63細(xì)胞的凋亡和周期相關(guān)蛋白的改變在藥物處理細(xì)胞48 h后，分別用digitonin buffer提取胞漿蛋白以及用RIPA提取細(xì)胞全蛋白進(jìn)行Western Blot實驗。相對于單純使用二甲雙胍或者SAHA，兩藥同時聯(lián)用時PARP切割更明顯，代表細(xì)胞凋亡明顯增加。線粒體是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡啟動以及調(diào)控的主要細(xì)胞器，而Cytochrome c (Cyto C)的釋放則是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志物，單藥處理時都只有輕微誘導(dǎo)Cytochrome c的釋放，而在共同作用的情況下，Cytochrome c的釋放量明顯增加。見圖5。結(jié)果從分子水平上表明，SAHA與二甲雙胍聯(lián)用具有協(xié)同激活MG63細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑的作用。除了凋亡標(biāo)志性蛋白的檢測外，通過Western Blot實驗還驗證了兩藥物對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。在降低抑凋亡蛋白Mcl-1與XIAP上，兩藥有明顯的協(xié)同作用。在促進(jìn)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)上，兩藥也有一定的協(xié)同作用。見圖5。

細(xì)胞周期蛋白可通過調(diào)控細(xì)胞周期從而影響細(xì)胞的增殖，為了弄清楚兩藥聯(lián)用抑制MG63細(xì)胞增殖的機制，還檢測了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P27，P21，Cyclin D1的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合后P27，P21上調(diào)明顯，而Cyclin D1下調(diào)明顯，見圖5，說明細(xì)胞周期進(jìn)程在聯(lián)合用藥后可能受到了阻滯。

3 討 論

二甲雙胍被廣泛用于Ⅱ型糖尿病的治療，它不僅能長期使用，而且還具有少毒性和相對便宜的優(yōu)點。近幾年的研究顯示，二甲雙胍可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[2-3]，且二甲雙胍可通過激活磷酸腺苷蛋白激酶(Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase,AMPK)信號通路抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長[7-8]而不依賴于其降血糖作用。組蛋白去乙?；?Histone Deacetylase,HDAC)是一類在表觀遺傳學(xué)層面調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)的酶，當(dāng)HDAC在一些腫瘤中過表達(dá)時，它與致癌因素是密切相關(guān)的[9-10]，而HDAC抑制劑SAHA可以在微摩爾濃度水平誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[11-12]。

圖4 二甲雙胍和SAHA聯(lián)合對MG63細(xì)胞凋亡的影響 A:凋亡代表圖；B:三次結(jié)果統(tǒng)計圖.1:Control;2:二甲雙胍 1 mmol/L;3:SAHA 0.1 μmol/L;4:SAHA 0.2 μmol/L;5:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.1 μmol/L;6:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.2 μmol/L.與SAHA 0.1 μmol/L組比較，a:P<0.01;與SAHA 0.2 μmol/L組比較，b:P<0.001

圖5 MG63細(xì)胞的凋亡和周期相關(guān)蛋白的改變 1:Control;2:二甲雙胍 1 mmol/L;3:SAHA 0.1 μmol/L;4:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.1 μmol/L

相對于單個藥物治療的方式，兩藥聯(lián)用具有用藥劑量小，毒副作用低的優(yōu)勢，并能克服單藥耐藥性。因此，本研究不僅觀察了二甲雙胍和SAHA單藥對骨肉瘤細(xì)胞增殖、克隆形成及凋亡的影響，也探索性的研究了二甲雙胍與SAHA同時聯(lián)合抑制腫瘤的作用。從研究結(jié)果可以看出，單獨使用二甲雙胍和SAHA都可在一定程度上抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡，但是在同時聯(lián)合兩種藥物之后，這種抗腫瘤效應(yīng)更加明顯。這不僅為二甲雙胍和SAHA的抗癌效應(yīng)增加了新的基礎(chǔ)研究證據(jù)，而且還有望在臨床治療中建立一種新型的毒副作用小、療效好的聯(lián)合化療模型。

在初步探討聯(lián)合用藥作用機制時，檢測了細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)的一些重要蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mcl-1，XIAP，Bim，Cyto C等凋亡相關(guān)蛋白和P27，P21，Cyclin D1等周期相關(guān)蛋白在聯(lián)合用藥時變化明顯。由于相對于單個靶分子藥物治療的方式，兩藥聯(lián)用具有多靶點的優(yōu)勢，所以推測兩藥聯(lián)用可能是通過影響眾多的信號通路蛋白的表達(dá)來達(dá)到抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。即二甲雙胍與SAHA具有協(xié)同作用是因為兩藥物的聯(lián)用能同時阻斷多種信號通路而導(dǎo)致的，兩藥共同作用時，細(xì)胞凋亡的閾值降低了，達(dá)到了協(xié)同的效果，但是具體藥物的最重要靶點是什么，靶點與靶點之間如何相互作用達(dá)到協(xié)同作用的，仍需繼續(xù)深入探討。目前研究認(rèn)為二甲雙胍的抗腫瘤作用可能與活化AMPK途徑抑制腫瘤生長相關(guān)[7,8]。AMPK參與體內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路，包括mTOR通路、p53/p21途徑、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路及脂肪酸和蛋白代謝相關(guān)通路的調(diào)控，從而阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白合成，引起細(xì)胞生長停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，二甲雙胍有可能通過激活A(yù)MPK途徑，導(dǎo)致癌細(xì)胞得不到足夠的細(xì)胞信號來分裂而直接發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。故SAHA與二甲雙胍聯(lián)合作用的機制有可能是通過對AMPK途徑的共同激活，不過這一點尚需進(jìn)一步深入研究。此外，由于本研究中二甲雙胍和SAHA的用藥濃度都很低，在IC50以下，故此時產(chǎn)生的聯(lián)合作用可能有細(xì)胞毒作用無關(guān)。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)二甲雙胍與SAHA治療骨肉瘤具有協(xié)同治療效果，并對可能的機制做了初步的探討，為日后此治療方法應(yīng)用于臨床治療提供了前期的研究證據(jù)。

[1] Meng Q,Zheng M,Liu H,et al.TRAF6 regulates proliferation,apoptosis,and invasion of osteosarcoma cell[J].Mol Cell Biochem,2012,371(1-2):177-186.

[2] Tomic T,Botton T,Cerezo M,et al.Metformin inhibits melanoma development through autophagy and apoptosis mechanisms[J].Cell Death Dis,2011,1(2):e199.

[3] Ashinuma H,Takiguchi Y,Kitazono S,et al.Antiproliferative action of metformin in human lung cancer cell lines[J].Oncol Rep,2012,28(1):8-14.

[4] Li C1,Liu VW,Chan DW,et al.LY294002 and metformin cooperatively enhance the inhibition of growth and the induction of apoptosis of ovarian cancer cells[J].Int J Gynecol Cancer,2012,22(1):15-22.

[5] Chan DK,Miskimins WK.Metformin and phenethyl isothiocyanate combined treatment in vitro is cytotoxic to ovarian cancer cultures[J].J Ovarian Res,2012,5(1):19.

[6] Marks PA,Miller T,Richon VM.Histone deacetylases[J].Curr Opin Pharmacol,2003,3(4):344-351.

[7] Zakikhani M,Dowling RJ,Sonenberg N,et al.The effects of adiponectin and metformin on prostate and colon neoplasia involve activation of AMP-activated protein kinase[J].Cancer Prev Res (Phila),2008,1(5):369-375.

[8] Rocha GZ,Dias MM,Ropelle ER,et al.Metformin amplifies chemotherapy-induced AMPK activation and antitumoral growth[J].Clin Cancer Res,2011,17(12):3993-4005.

[9] Bajbouj K,Mawrin C,Hartig R,et al.P53-dependent antiproliferative and pro-apoptotic effects of trichostatin A (TSA) in glioblastoma cells[J].J Neurooncol,2012,107(3):503-516.

[10] Cheng DD,Yang QC,Zhang ZC,et al.Antitumor activity of histone deacetylase inhibitor trichostatin A in osteosarcoma cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(4):1395-1399.

[11] Wu Z,Ma C,Shan Z,et al.Histone deacetylase inhibitors suppress the growth of human osteosarcomas in vitro and in vivo[J].J BUON,2013,18(4):1032-1037.

[12] Shao Y,Gao Z,Marks PA,et al.Apoptotic and autophagic cell death induced by histone deacetylase inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(52):18030-18035.

[13] 陳兆煜,王連唐,陳雁揚.二甲雙胍通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抗腫瘤機制[J].中國肺癌雜志，2013，16(8)：427-432.

EffectofCombiningMetforminandSuberoylanilideHydroxamicAcidontheProliferationandApoptosisofOsteosarcomaCells

SHEN Yingying,SU Xiaotao,OU Jun,et al

(InstituteofClinicalMedicine,FirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,

Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of combining metformin and suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma MG-63 cells.MethodsMG-63 cells were treated with metformin and SAHA for 72 h.The proliferation of MG-63 was tested by MTS assay.The capability of colony formation of MG-63 was assessed by clonogenicity assay.The cell apoptosis was detected by flow cytometry.The cell cycle and apoptosis associated proteins were assessed by Western Blot.ResultsMetformin or SAHA could inhibit the proliferation of MG-63 cells,respectively,and the cell proliferation was inhibited more obviously after combination of theses two drugs.Moreover,combination of two drugs could inhibit colony formation and promote cell apoptosis more significantly.P27,P21,Cyclin D1,Mcl-1,XIAP,Bim,Cytochrome C were significantly changed after the combination therapy.ConclusionCombination of metformin and SAHA could inhibit proliferation and colony formation and promote apoptosis more effectively in MG-63 cells.

metformin; suberoylanilide hydroxamic acid; osteosarcoma; proliferation; apoptosis

R738.1

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.003

2015-10-24；

2015-12-28

國家自然科學(xué)基金(81502276)．

*通訊作者，E-mail:henry200333@126.com．

蔣湘蓮)