肉及肉制品中大鼠成分PCR檢測(cè)方法研究

李宗夢(mèng)，趙良娟，馬興，趙宏，鄭文杰，張宏偉，武鵬程，尹長(zhǎng)城

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300461；2.北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，北京101318）

肉及肉制品中大鼠成分PCR檢測(cè)方法研究

李宗夢(mèng)1，趙良娟1，馬興1，趙宏1，鄭文杰1，張宏偉1，武鵬程2，尹長(zhǎng)城2

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300461；2.北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，北京101318）

我國(guó)肉類摻假現(xiàn)象屢禁不止，尤以使用來(lái)源不明的鼠肉冒充高價(jià)肉販賣最為惡劣。褐家鼠（Rattusnorvegicus）俗稱大鼠，由于分布廣、數(shù)量多、體型較大的特點(diǎn)最容易成為肉類摻假的來(lái)源。針對(duì)我國(guó)缺乏肉及肉制品中大鼠成分檢測(cè)方法的問(wèn)題，本研究針對(duì)包括大鼠在內(nèi)的共17種動(dòng)物線粒體cytb基因序列進(jìn)行分析比對(duì)，設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物。該方法特異性好，可檢出混合樣品中低至0.1%的大鼠成分，靈敏度較高。結(jié)果表明，本方法對(duì)熱處理混合肉樣品和市售樣品也具有較好的檢測(cè)能力，靈敏度達(dá)到0.1%。本研究為肉類食品安全監(jiān)管提供了新方法。

肉制品；PCR；大鼠；食品摻假

2013年初隨著歐洲“馬肉風(fēng)波”這一食品安全事件的發(fā)生，食品摻假這一全球性問(wèn)題引發(fā)了公眾對(duì)食品安全的擔(dān)憂以及各國(guó)政府的關(guān)注。我國(guó)常見肉類摻假現(xiàn)象多以在牛羊肉中摻入價(jià)格便宜的豬肉、鴨肉為主，更為惡劣的是有媒體報(bào)道某些不法商販用死老鼠肉制成羊肉串進(jìn)行販賣。此類惡性摻假行為多見于流動(dòng)攤販，難于監(jiān)管。作為各種疫病傳播的載體，人食用鼠肉制品存在感染疫病的風(fēng)險(xiǎn)，還可能導(dǎo)致鼠藥二次中毒。由此可見，此類惡性肉類摻假事件已經(jīng)嚴(yán)重威脅到消費(fèi)者健康和公共安全，對(duì)政府監(jiān)管部門和檢測(cè)機(jī)構(gòu)提出了新的挑戰(zhàn)。

褐家鼠（Rattusnorvegicus），別稱溝鼠、大家鼠或挪威鼠，是我國(guó)最常見和危害最大的一種家鼠。由于其體型大、分布廣、數(shù)量大，最容易成為鼠肉摻假的來(lái)源。除此之外，用于科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)大鼠，如Wistar大鼠[1]、Sprague Dawley大鼠[2]等也屬于褐家鼠種。此類大鼠使用量大且經(jīng)過(guò)未知藥物處理，其肉制品一旦流入市場(chǎng)，將對(duì)食品安全造成嚴(yán)重威脅。

近年來(lái)基于核酸和蛋白質(zhì)的多種分子生物學(xué)物種鑒定方法被相繼開發(fā)和應(yīng)用。相較于蛋白質(zhì)，DNA熱穩(wěn)定性高，物種間多態(tài)性豐富，使其成為重要分子靶標(biāo)。其中，線粒體DNA在細(xì)胞中含量豐富，進(jìn)化速度快，用作遺傳分析靈敏度高，具有較高的種間多樣性和較低的種內(nèi)變異[3-5]。常用的線粒體靶基因有細(xì)胞色素b（cytb）基因[6-8]、12S和16S核糖體RNA亞基[9-10]、D-loop區(qū)[11-13]等?；诰€粒體靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用單重或多重PCR技術(shù)對(duì)動(dòng)物源性成分進(jìn)行定性或半定量鑒別已被研究者廣泛采用[14-18]。然而，鼠源性成分尤其是大鼠成分鑒定的研究較少且大多以細(xì)胞系污染分析為目的。如Almeida等采用多重PCR及測(cè)序技術(shù)分析小鼠細(xì)胞系中短串聯(lián)重復(fù)序列（Short tandem repeat）進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行鑒別[19]。Higgins等采用單重PCR法，使用商品化試劑盒對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞系進(jìn)行鑒別以區(qū)分大鼠、小鼠來(lái)源的細(xì)胞系污染[20]。食品中尤其是肉及肉制品中鼠源性成分鑒別方法鮮見報(bào)道。

本研究通過(guò)分析褐家鼠（Rattusnorvegicus）及其他常見畜禽品種線粒體細(xì)胞色素b（cytb）基因序列，設(shè)計(jì)并篩選可特異性擴(kuò)增褐家鼠目的片段的PCR引物，所得PCR產(chǎn)物大小為397 bp。結(jié)果顯示，該方法特異性好，靈敏度可達(dá)到0.1%，適用于肉及肉制品中大鼠源性成分檢測(cè)。

1 材料

1.1 樣品

大鼠新鮮組織樣本由天津中醫(yī)藥大學(xué)饋贈(zèng)。其余16種用于特異性實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物樣本或基因組DNA為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備樣品，均在識(shí)別動(dòng)物整體形態(tài)條件下采樣，經(jīng)過(guò)基因組測(cè)序和比對(duì)確認(rèn)為相應(yīng)物種。靈敏度實(shí)驗(yàn)中作為基質(zhì)的羊肉樣品購(gòu)買于本地超市，依照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)PCR法》確認(rèn)羊成分。從天津市濱海新區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市、燒烤攤共購(gòu)買18份羊肉制品。其中羊肉串9份、冷凍羊肉卷、羊肉片6份、羊肉餡3份。從福建省寧化縣、龍巖、南平及廣西宜州購(gòu)買可食用鼠肉制品共4份，均為熏制鼠肉干。所有樣品使用無(wú)菌水清洗去除多余的腌漬醬料、骨、皮部分，使用潔凈的均質(zhì)器進(jìn)行混勻。

1.2 儀器與試劑

主要儀器包括終點(diǎn)PCR儀（PTC-200，MJResearch，加拿大），GelDoc XR凝膠分析系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，美國(guó)），核酸蛋白分析儀（1510，Thermo Fisher，美國(guó)）。動(dòng)物組織基因組提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；HSEx Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、6 x Loading Buffer購(gòu)自大連寶生物公司。引物合成和測(cè)序均由上海生物工程公司完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

從GenBank中獲得大鼠及其他16種常見畜禽動(dòng)物線粒體cytb基因序列，物種及序列信息見表1。

表1 物種GenBank序列號(hào)Table1 GenBank accession number of anim als

使用Geneious6.0（Biomatters Ltd.，New Zealand）進(jìn)行序列分析，設(shè)計(jì)大鼠特性引物Rat-CYT-F1/R1。擴(kuò)增片段大小為397 bp，引物序列見表2。

表2 大鼠PCR引物序列Table2 Primer sequenceof ratspecific PCR

2 方法

2.1 基因組DNA提取

依照Promega公司動(dòng)物組織基因組提取試劑盒操作說(shuō)明對(duì)本研究中所有動(dòng)物組織進(jìn)行基因組DNA提取，初始樣本量為10mg。

2.2 核酸純度及濃度測(cè)定

提取的DNA樣品采用核酸蛋白分析儀進(jìn)行純度和濃度測(cè)定。A260/A280比值介于1.8～2.0之間的DNA樣品用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

2.3 PCR反應(yīng)體系

20μLPCR反應(yīng)體系中含10×PCR buffer（含Mg2+）2μL；10mmol/LdNTP混合液2μL；引物（5μmol/L）各0.8μL；HSEx Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2μL；DNA模板（10μg/mL）1μL。

2.4 PCR擴(kuò)增條件

94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃ 30 s；72℃5min，30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物特異性實(shí)驗(yàn)

采用2.3、2.4中PCR體系及反應(yīng)條件，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，對(duì)雞、鴨、鵝、貓、狗、豬、馬、牛、水牛、綿羊、驢、鹿、駱駝、兔、貂、狐貍以及大鼠基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性。擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 引物特異性實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Gelelectrophoresisof PCR products in specificity test

如圖1所示，引物Rat-CYT-F1/Rat-CYT-R1對(duì)大鼠DNA擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，擴(kuò)增片段大小為397 bp。其他16個(gè)物種及空白對(duì)照擴(kuò)增為陰性，說(shuō)明該引物對(duì)檢測(cè)大鼠成分具有良好的特異性。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序、比對(duì)，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段序列分別與大鼠cytb基因目的片段具有100%同源性，進(jìn)一步確證了PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。

3.2 絕對(duì)靈敏度實(shí)驗(yàn)

將大鼠基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，制成100、10、1、0.1、0.01μg/mL的模板。以無(wú)菌水為空白對(duì)照，按2.3、2.4中反應(yīng)體系對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

圖2 絕對(duì)靈敏度實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Gelelectrophoresisof PCR products in absolutesensitivity test

結(jié)果顯示，隨稀釋度增加，大鼠陽(yáng)性擴(kuò)增條帶逐漸減弱，其中模板濃度為100、10、1、0.1μg/mL時(shí)均出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。而0.01μg/mL及空白對(duì)照擴(kuò)增為陰性。確定其最低絕對(duì)靈敏度為0.1μg/mL。

3.3 實(shí)際靈敏度實(shí)驗(yàn)

選用常見摻假對(duì)象羊肉作為基質(zhì)肉，制備大鼠肉與基質(zhì)肉的梯度混合樣品?；旌媳壤秊?0%、1%、0.1%、0.01%?；旌先鈽悠愤M(jìn)行基因組DNA提取，濃度調(diào)整為10μg/mL。以大鼠DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以羊DNA作為陰性對(duì)照，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，按2.3、2.4中反應(yīng)體系對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

圖3 實(shí)際靈敏度實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Gelelectrophoresisof PCR productsam plified from meat m ixture

結(jié)果顯示，大鼠陽(yáng)性對(duì)照、比例為10%、1%、0.1%的大鼠肉、羊肉混合樣品均能擴(kuò)增出條帶。隨大鼠肉混合比例下降，條帶亮度有下降趨勢(shì)。而0.01%混合比例及陰性對(duì)照、空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。該結(jié)果顯示本方法可用于檢測(cè)混合肉中大鼠成分，靈敏度可達(dá)到0.1%。

3.4 高溫處理對(duì)方法靈敏度的影響

將3.3中所述大鼠肉、羊肉混合樣品經(jīng)100℃處理30min，按2.1所述方法進(jìn)行基因組DNA提取。以大鼠DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以羊DNA作為陰性對(duì)照，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，按2.3、2.4中反應(yīng)體系對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

圖4 高溫處理樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Gelelectrophoresisof PCR productsam plified from heat treatedm eatm ixture

結(jié)果顯示，10%、1%、0.1%混合肉樣品經(jīng)過(guò)高溫處理后仍可以成功擴(kuò)增出目的條帶，隨大鼠成分比例下降，條帶擴(kuò)增亮度下降趨勢(shì)相較于未經(jīng)熱處理樣品更為明顯（見圖3）。而0.01%混合比例及陰性對(duì)照、空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。此結(jié)果說(shuō)明經(jīng)高溫處理的樣品應(yīng)用本方法時(shí)，擴(kuò)增效率會(huì)有所降低，但仍能將0.1%混合比例的樣品中大鼠成分檢出，方法穩(wěn)健性較好。

3.5 市售肉類樣品檢測(cè)

以大鼠DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，用建立的方法對(duì)18份市售羊肉制品及4份鼠肉制品進(jìn)行大鼠成分檢測(cè)。結(jié)果見圖5。

圖5 市售肉類樣品大鼠成分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Gelelectrophoresisof PCR productsamplified from comm ercialm eat products

凝膠電泳結(jié)果顯示，從市面購(gòu)得的所有羊肉制品均未檢出大鼠成分，而4種鼠肉制品均檢出大鼠成分?？瞻讓?duì)照則無(wú)擴(kuò)增。將4種鼠肉制品PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中大鼠基因序列具有>99%同源性。

4 結(jié)論

考慮到經(jīng)濟(jì)利益和可獲得性，小鼠體型小、可獲得肉含量不足以驅(qū)使鼠肉摻假行為。而分布最廣、來(lái)源多、肉含量大的褐家鼠（大鼠）則可能成為不法分子非法添加的目標(biāo)。為解決我國(guó)肉及肉制品中大鼠成分檢測(cè)方法不足的問(wèn)題，本研究通過(guò)搜集大鼠及其他16種常見畜禽動(dòng)物線粒體cytb基因序列并進(jìn)行分析比對(duì)，設(shè)計(jì)篩選出大鼠特異性引物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法對(duì)16種動(dòng)物基因組DNA均無(wú)非特異擴(kuò)增，具有很好的特異性。在肉制品加工過(guò)程中常見的腌制、熏制及高溫加熱等處理方式往往造成DNA損傷或降解，最終影響獲得的DNA質(zhì)量[21]。結(jié)果表明，本方法可成功檢測(cè)混合生肉制品及熱處理混合肉制品中大鼠成分，靈敏度為0.1%，對(duì)于加工肉制品也具有一定的適用性。Fang等報(bào)道了采用Taqman探針?lè)蓪?duì)鼠源性成分進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，但該方法無(wú)法區(qū)分大鼠、小鼠成分[22]。此外，實(shí)時(shí)熒光PCR方法成本高，對(duì)技術(shù)人員要求也較高，不利于推廣使用。本方法基于傳統(tǒng)PCR方法，成本低、操作簡(jiǎn)便，更適用于一些經(jīng)費(fèi)有限的實(shí)驗(yàn)室采用，有助于相關(guān)部門對(duì)肉類食品安全實(shí)施監(jiān)管。

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Detection of Rat Com ponents in M eat and M eat Products by PCR

LIZong-meng1，ZHAO Liang-juan1，MAXing1，ZHAOHong1，ZHENGWen-jie1，ZHANGHong-wei1，WUPeng-cheng2，YINChang-cheng2
（1.Animal，Plantand Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China；2.Beijing Protein Innovation Co.，Ltd.，Beijing101318，China）

Meat fraud has been a problem for a long time in China.Adulteration ofmurinemeatwith unknown resource intohigh pricedmeathasbeen theworst.Brown rat（Rattusnorvegicus）which isnormally referred asrathasbecome themost possible resource formeatadulteration due to its broad distributions，large population and bigger size.There is lack ofdetectionmethod aimingat ratcomponents inmeatandmeatproducts in China. In this study，sequences of cytb gene coming from 17 animal species including ratwas analyzed and a pair of primers specifically targeting ratwas designed.The primers showed high specificity and sensitivity bywhich 0.1 %of ratmeat inmeatmixturewasdetectable.Moreover，thismethod wasalsoapplied to heat treatedmeatmixturesand commercialmeatproductswith sensitivity of0.1%.Thisstudy provided anew tool to control thequality ofmeatproducts forofficial laboratories.

meatproducts；PCR；rat；food fraud

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.026

2016-10-24

國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2015IK278）

李宗夢(mèng)（1983—），女（漢），工程師，博士，研究方向：食品安全檢測(cè)。