藏漢人群EPAS1、EGLN1基因特異SNP位點遺傳多態(tài)性

楊 鑫，胡 萌，張子龍，駱繼懷，哈 飛，馬麗英，孫紅兵,*

（1.甘肅省證據(jù)科學技術研究與應用重點實驗室，蘭州 730070；2.蘭州市公安局刑事科學技術研究所，蘭州 730030；3.鐵道警察學院，鄭州 450053）

藏漢人群EPAS1、EGLN1基因特異SNP位點遺傳多態(tài)性

楊 鑫1,2，胡 萌3,*，張子龍1，駱繼懷1,2，哈 飛1,2，馬麗英1，孫紅兵1,2,*

（1.甘肅省證據(jù)科學技術研究與應用重點實驗室，蘭州 730070；2.蘭州市公安局刑事科學技術研究所，蘭州 730030；3.鐵道警察學院，鄭州 450053）

目的 對青海、甘肅境內518名藏族無關個體和平原地區(qū)134名漢族無關個體EPAS1和EGLN1基因的10個SNP位點做遺傳多態(tài)性分析。方法 使用SNaPshot?多重分析試劑盒分析藏漢人群rs12907901、rs13419896、rs150877473、rs1562453、rs186996510、rs2491406、rs2491407、rs4953360、rs4953361、rs7589621共10個SNP位點的基因型、等位基因頻率等遺傳學參數(shù)。結果 根據(jù)基因型頻率分析，漢族群體上述位點所有基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡，藏族人群rs150877473、rs1562453、rs186996510、rs7589621共4個位點不符合Hardy-Weinberg平衡（p＜0.05），同時兩組人群rs13419896、rs1562453、rs186996510、rs7589621、rs4953360共5個位點存在顯著差異；根據(jù)等位基因頻率分析，藏漢人群在rs150877473、rs1562453、rs186996510、rs7589621共4個位點存在顯著差異。結論 本研究驗證了EPAS1、EGLN1基因在藏漢群體間的差異性，為SNP分子遺傳標記應用于刑事科學實踐提供了理論支持。

EPAS1；EGLN1；SNP；遺傳多態(tài)性

藏族作為世界高原人群中居住海拔最高、適應歷史最長的群體，主要分布于尼泊爾、印度、巴基斯坦、不丹及中國的西藏、青海、甘肅、四川、云南等省。據(jù)全國第五次人口普查數(shù)據(jù)顯示，中國現(xiàn)有藏族總人口為628 2187人，是全國第三大少數(shù)民族。近年來，國內外很多重要研究發(fā)現(xiàn)高原藏族人群EPAS1及EGLN1基因中多個SNP位點連鎖單倍型及頻率與平原地區(qū)漢族人群存在顯著差異[1-4]。與此同時，法醫(yī)遺傳學者不斷探討利用特定功能基因中的特異性分子標記，鑒別未知個體的民族屬性或地域來源[5-8]，從而可為刑事偵查、安全防控等工作提供參考或理論依據(jù)。

本文通過分析甘肅、青海兩省藏族聚居區(qū)藏族無關個體和平原地區(qū)漢族無關個體EPAS1和EGLN1基因的10個SNP位點的多態(tài)性，研究上述SNP位點在藏漢人群間存在的差異，為以后利用SNP遺傳位點多態(tài)性差異對相關個體的民族屬性或地域來源推斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

收集青海果洛藏族自治州（E99°73′, N33°40′, H4017m）與海北藏族自治州（E101°33′, N37°22, H3644m）、甘肅甘南藏族自治州瑪曲縣（E100°77′, N34°87′, H3835m）和天祝藏族自治縣（E103°01′, N36°48′, H2178m）共2個省份4個藏族聚居區(qū)的藏族人群共518個無關個體的血樣，選取海拔低于500米的平原（山東、河南、安徽3?。h族人群134位無關個體作對照。

1.2 儀器及試劑

美國Thermo Fisher的高速離心機、平板高速離心機、振蕩器、PCR擴增儀、測序儀、；美國Bio-Rad的凝膠成像儀；美國Roche 的DNA聚合酶；北京TIANGEN的血液基因組DNA提取試劑盒；美國Qiagen的血卡樣本基因組DNA提取試劑盒；美國Thermo Fisher的 SNaPshot?多重分析試劑盒。

1.3 DNA提取

全血樣本DNA采用血液基因組DNA提取系統(tǒng)提取，血卡樣本DNA采用Investigator Kit提取。提取產物終濃度在20 ng/μL以上。

1.4 特異性SNP位點選擇

選取文獻報道[9-13]且存在顯著性差異的SNP位點 rs12907901、rs13419896、rs150877473、rs1562453、rs186996510、rs2491406、rs2491407、rs4953360、rs4953361、rs7589621共10個（見表1）行研究。

表1. SNP位點信息匯總表Table 1 Information of selected SNPs

1.5 引物設計與多重PCR體系建立

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫內上述位點相關序列，使用Primer6.0軟件設計引物，引物要求具有特異性，片段長度存在差異，PCR反應的退火溫度范圍集中但略有差異。

根據(jù)擴增片段的長度，將10個SNP遺傳標記按照SNaPshot?多重分析試劑盒設計要求，進行分配并構建多重PCR體系。為了改變引物的長度，區(qū)分不同的位點，在引物的5’端添加GACT為重復單元的單堿基重復序列尾巴；根據(jù)dT數(shù)量的差異，每個相鄰檢出位點的SNP引物堿基數(shù)差異保持在3～8個堿基之間。SNP位點及SNaPshot引物信息參見表2。

1.6 SNP遺傳多態(tài)性分析

檢測EPAS1、EGLN1基因上述SNP位點在134名平原漢族無關個體以及518名青海、甘肅藏族無關個體中的基因型，計算各SNP位點等位基因頻率、基因型等信息，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗、連鎖不平衡原漢族人群。

表2. SNaPshot引物信息匯總表Table 2 Information of SNaPshot primers

2 結果

2.1 10個SNP位點的遺傳多態(tài)性

通過對134名平原漢族無關個體以及518名青海、甘肅藏族無關個體EPAS1、EGLN1基因10個特異SNP位點的分型檢驗和分析，其基因型及等位基因頻率分布等群體遺傳學參數(shù)見表3?？梢钥闯?，漢族人群10個SNP位點基因型分布頻率介于1～112之間（n=134），所有10個位點均符合Hardy-Weinberg平衡；而藏族人群相應10個SNP位點的基因型分布頻率介于58～256之間（n=518），其中有rs150877473、rs1562453、rs186996510、rs7589621共4個位點不符合Hardy-Weinberg平衡（p＜0.05）。

在134名漢族個體的10個位點中，有5個位點的特定基因型檢出率不足10 %，分別為rs150877473（GG，n=1）、rs186996510（CC，n=1）、rs1562453（TT，n=2）、rs7589621（GG，n=9）、rs4953360（AA， n=6）；而藏族人群樣本中尚未發(fā)現(xiàn)基因型檢出率不足10 %的位點。此外， rs2491406和rs2491407兩個位點均位于EGLN1基因中，兩個位點相隔263個堿基，呈高度連鎖遺傳，故基因型頻率完全一致。藏漢人群上述兩個基因SNP位點連鎖分析結果見圖1～4。

表3. 藏漢人群相關SNP位點基因型統(tǒng)計表Table 3 Genotype frequencies of SNPs in Tibetan and Han populations

圖1 藏族EPAS1 6個SNP位點連鎖不平衡分析Fig.1 Linkage disequilibrium among the 6 SNPs of EPAS1 in Tibetan population

圖2 藏族EGLN1 4個SNP位點連鎖不平衡分析Fig.2 Linkage disequilibrium among the 4 SNPs of EGLN1 in Tibetan population

圖3 漢族EPAS1 6個SNP位點連鎖不平衡分析Fig.3 Linkage disequilibrium among the 6 SNPs of EPAS1 in Han population

圖4 漢族EGLN1 4個SNP位點連鎖不平衡分析Fig.4 Linkage disequilibrium among the 4 SNPs of EGLN1 in Han population

由表4可以看出，藏漢人群EPAS1、EGLN1基因10個SNP位點等位基因頻率分布也存在差異，其中漢族人群10個SNP位點等位基因分布頻率介于0.0858～0.9142之間（rs150877473、rs186996510），而藏族人群10個SNP位點等位基因分布頻率介于0.3089～0.6911之間，多態(tài)性及正態(tài)分布均衡性高于漢族人群。

表4. 藏漢人群相關SNP位點等位基因頻率統(tǒng)計表Table 4 Allele frequencies of SNPs in Tibetan and Han populations

2.2 10個SNP位點的遺傳多態(tài)性在藏漢人群間的比較

分析表3中藏漢人群EPAS1、EGLN1基因10個SNP位點基因型頻率的差異發(fā)現(xiàn)，rs13419896、rs1562453、rs186996510、rs7589621、rs4953360共5個位點的基因型頻率存在統(tǒng)計學差異，這一結論與表4中等位基因頻率差異的結論相似，后者有rs150877473、rs1562453、rs186996510、rs7589621共4個位點的等位基因頻率在藏漢人群間存在差異。值得注意的是，等位基因頻率存在差異的4個位點全部為藏族人群Hardy-Weinberg檢驗不平衡的位點。

3 討論

EPAS1（Endothelial PAS Domain Protein 1） 基因，又稱為HIF-2α，定位于人染色體2p16-21，含有16個外顯子，序列長度約90kb。該基因在低氧條件能夠明顯提高細胞內HIF-2α蛋白含量，其機制是HIF-2α蛋白內存在一種依賴氧壓的降解域，在常氧條件下HIF-2α蛋白質能夠迅速地降解，而低氧能夠提高HIF-2α蛋白質的穩(wěn)定性，使其含量升高。EGLN1（egl nine homolog 1）是調節(jié)HIF-1α的一個關鍵分子，它能夠直接感受氧分壓，是一種雙加氧酶的氧感受器，通過催化HIF脯氨酸殘基發(fā)生羥化反應介導其降解。上述兩個基因是HIF通路中的重要基因，在人對低氧環(huán)境的調節(jié)通路中起到核心作用，與缺氧應激、急慢性高山病等均存在顯著關聯(lián)[9-10]。

近年來，國內外很多重要研究發(fā)現(xiàn)高原藏族人群EPAS1及EGLN1基因中多個SNP位點連鎖單倍型及頻率與平原地區(qū)漢族人群存在顯著差異。Peng[2]研究了7個藏族人群共1334名個體的EPAS1/ EGLN1基因SNP位點后，發(fā)現(xiàn)藏族人群EPAS1基因rs13419896（A；藏族0.54～0.86，漢族0.28，日本人0.39）、rs4953354（G；藏族0.42～0.83，漢族0.13，日本人0.12）、rs1868092（A；藏族0.33～0.81，漢族0.08，日本人0.09）和rs2275279（T；藏族0.53～0.74，漢族0.32，日本人0.24）共4個SNP位點在頻率上與平原漢族及日本人有顯著性差異。Xiang[11]對46名藏族無關個體EGLN1基因中相關SNP分析發(fā)現(xiàn)，藏族在位點rs186996510的非同義突變（C-G）頻率與平原人群存在顯著差異，不同地區(qū)藏族人群中C-C基因型的頻率介于0.6429～0.7583，而中國漢族、日本人、歐洲人及非洲人該基因型頻率分別只有0.0103、0.0056、0.0059、0.0227；類似的結論也存在于位點rs12097901。柯金坤[12]分別選取海拔4454 m的西藏浪卡子縣藏族、海拔3100 m的青海貴南縣藏族、海拔2500 m的云南貢山縣藏族及山東平原漢族EPAS1基因14個SNP位點進行分析，發(fā)現(xiàn)rs1562453位點的等位基因頻率在藏漢人群之間存在顯著差異，而rs4953361位點的等位基因頻率雖然在云南藏族與漢族人群之間差異不顯著，但在西藏藏族、青海藏族與漢族人群間存在顯著差異，顯示長期高海拔環(huán)境對世居人群EPAS1基因有選擇作用，并可造成藏漢人群在相關基因SNP位點頻率及多態(tài)性上存在穩(wěn)定遺傳的差異。

根據(jù)基因型頻率分析，漢族群體上述位點所有基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡，藏族人群rs150877473、rs1562453、rs186996510、rs7589621共4個位點不符合Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），同時兩組人群rs13419896、rs1562453、rs186996510、rs7589621、rs4953360共5個位點存在顯著差異；根據(jù)等位基因頻率分析，藏漢人群在rs150877473、rs1562453、rs186996510、rs7589621共4個位點存在顯著差異。這些基因型及等位基因頻率方面的差異驗證了前期Xiang[11]、柯金坤[12]、Yi[13]等人的相關研究中關于藏漢人群在EPAS1、EGLN1基因中存在差異的事實，其相應位點在藏族人和平原漢族之間的差異相似或接近，由此說明這些基因及其SNP位點在藏漢人群間的差異性是客觀、穩(wěn)定的[14-18]。這一結論為從生物學角度研究人類在極端環(huán)境（高原和高山）下進化及遺傳適應性提供了條件。而且，這些差異的深入研究和探索，極有可能為推斷相關人員的藏民族屬性或具體地域來源提供指向性線索，具有重要的研究價值和應用前景。

本研究在樣本數(shù)量、SNP位點數(shù)量及特異性選擇方面的工作還需加強，特別是通過這些SNP位點區(qū)分漢藏人群民族屬性方面仍有很多工作要完善。法醫(yī)物證鑒定中關于個體身份辨識能力的諸多研究指出，要達到現(xiàn)有AmpFlSTR Identifiler 試劑盒鑒別個體身份的水平，其相應的SNP位點使用數(shù)量至少需達到或超過38～43個，且這些SNP位點必須滿足雜合度高(≥0. 4)、不同人群間等位基因頻率差別小( Fst＜0. 06) 及遺傳標記間沒有顯著的連鎖狀態(tài)這三個要求[19-21]。由此可見，本文的研究還需在以后重點加強兩方面的研究，一是篩選和驗證更多特異性的SNP位點，如rs1868092[9]、rs480902[9]、rs4953354[16]、rs13428739[22]等；二是建立基于系統(tǒng)進化理論的數(shù)學模型或統(tǒng)計學公式。這樣利用EPAS1、EGLN1基因特異SNP位點鑒別藏漢人群民族屬性的能力和證據(jù)強度將會大幅提升。

［1］ Wu T. The Qinghai-Tibetan plateau: how high do Tibetans live?［J］ High Alt Med Biol, 2001, 2(4): 489-499.

［2］ Peng Y, Yang Z, Zhang H, et al. Genetic variations in Tibetan populations and high-altitude adaptation at the Himalayas［J］. Mol Biol Evol, 2010, 28(2): 1075-1081.

［3］ Simonson TS, McClain DA, Jorde LB, et al. Genetic determinants of Tibetan high-altitude adaptation［J］. Hum Genet, 2012, 131(4): 527-533.

［4］ Wu T, Kayser B. High altitude adaptation in Tibetans［J］. High Alt Med Biol, 2006, 7(3): 193-208.

［5］ Amorim, A., L. Pereira. Pros and cons in the use of SNPs in forensic kinship investigation: a comparative analysis with STRs［J］. Forensic Sci Int, 2005, 150: 17-21.

［6］ 孫啟凡, 趙蕾, 江麗, 等. DNA來源人特征刻畫的法庭科學應用研究［J］. 刑事技術, 2015, 40(3): 232-235.

［7］ Sturm RA, Frudakis TN. Eye colour: portals into pigmentation genes and ancestry［J］. Trends Genet, 2004, 20(8): 327-332.

［8］ Sturm RA. Molecular genetics of human pigmentation diversity［J］. Hum Mol Genet, 2009, 18(R1): R9-17.

［9］ Buroker NE, Ning XH, Zhou ZN, et al. EPAS1 and EGLN1 associations with high altitude sickness in Han and Tibetan Chinese at the Qinghai-Tibetan Plateau［J］. Blood Cells Mol Dis, 2012, 49(2): 67-73.

［10］ Bigham AW, Lee FS. Human high-altitude adaptation: forward genetics meets the HIF pathway［J］. Genes Dev, 2014, 28(20): 2189-2204.

［11］ Xiang K, Ouzhuluobu, Peng Yi, et al. Identification of a Tibetanspecific mutation in the hypoxic gene EGLN1 and its contribution to high-altitude adaptation［J］. Mol Biol Evol, 2013, 30(8): 1889-1898.

［12］ 柯金坤. 不同海拔三個藏族人群HIF-1α基因與HIF-2α基因多態(tài)位點的比較研究［D］. 北京: 北京協(xié)和醫(yī)科大學, 2010.

［13］ Yi X, Liang Y, Huerta-Sanchez E, et al. Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to high altitude［J］. Science, 2010, 329: 75-78.

［14］ Beall CM, Cavalleri GL, Deng L, et al. Natural selection on EPAS1 (HIF2) associated with low hemoglobin concentration in Tibetanhighlanders［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(25): 11459-11464.

［15］ Simonson TS, Yang Y, Huff CD, et al. Genetic evidence for high-altitude adaptation in Tibet［J］. Science, 2010, 329: 72-75.

［16］ Hanaoka M, Droma Y, Basnyat B, et al. Genetic variants in EPAS1 contribute to adaptation to high-altitude hypoxia in Sherpas［J］. PLoS One, 2012, 7(12): e50566.

［17］ Beall CM. Andean, Tibetan, and Ethiopian patterns of adaptation to high-altitude hypoxia［J］. Integr Comp Biol, 2006, 46(1): 18-24.

［18］ Xu S, Li S, Yang Y, et al. A genome-wide search for signals of high-altitude adaptation in Tibetans［J］. Mol Biol Evol, 2011, 28(2): 1003-1011.

［19］ Kidd KK, Pakstis AJ, Speed WC, et al. Developing a SNP panel for forensic identification of individuals［J］. Forensic Sci Int, 2006, 164(1): 20-32.

［20］ Pakstis AJ, Speed WC, Kidd JR, et al. Candidate SNPs for a universal individual identification panel［J］. Hum Genet, 2007, 121(3-4): 305-317.

［21］ Gill P. An assessment of the utility of single nucleotide polymorphisms (SNPs) for forensic purposes［J］. Int J Legal Med, 2001, 114(4-5): 204-210.

［22］ Xu XH, Huang XW, Qun L, et al. Two functional loci in the promoter of EPAS1 gene involved in high-altitude adaptation of Tibetans［J］. Sci Rep, 2014, 4: 7465.

Genetic Polymorphism of SNPs in EPAS1/EGLN1 among Tibetan and Han Populations

YANG Xin1,2, HU Meng3,*, ZHANG Zilong1, LUO Jihuai1,2, HA Fei1,2, MA Liying1, SUN Hongbing1,2,*
(1. Key Laboratory of Research and Application of Evidential Science and Technology, Lanzhou 730070, China;
2. Institute of Forensic Science, Lanzhou Public Security Bureau, Lanzhou 730030, China;
3. Railway Police College, Zhengzhou 450053, China)

Objective To study the genetic polymorphism of 10 SNPs in genes EPAS1 and EGLN1 among 518 unrelated Tibetan individuals from Gansu and Qinghai areas and 134 unrelated Han individuals from 500-meter altitude regions. Methods 10 SNP markers (rs12907901, rs13419896, rs150877473, rs1562453, rs186996510, rs2491406, rs2491407, rs4953360, rs4953361, rs7589621) in genes EPAS1 and EGLN1 were selected to analyze their genetic information such as genotype frequency and allele frequency through SNaPshot?Multianalysis kit. Results According to genotype frequency analysis, no deviation was detected from the Hardy-Weinberg equilibrium in Han population, yet 4 SNPs (rs150877473, rs1562453, rs186996510, rs7589621) in Tibetan population to deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (p＜0.05). Meanwhile, significant differences were also observed in the distribution of genotype frequency in 5 SNPs (rs13419896, rs1562453, rs186996510, rs7589621, rs4953360) between the Tibetan and Han populations. The allele frequency analysis showed that there were significant differences in 4 SNPs (rs150877473, rs1562453, rs186996510, rs7589621) between the two populations. Conclusions This research verified the previous report that there was significant difference between Tibetan andHan populations in EPAS1 and EGLN1 SNPS genes, providing a further support for these SNP genetic markers to be used in the future forensic practice.

EPAS1; EGLN1; SNP; genetic polymorphism

DF795.2

B

1008-3650(2016)04-0340-05

2015-08-20

格式：楊鑫，胡萌，張子龍，等. 藏漢人群EPAS1、EGLN1基因特異SNP位點遺傳多態(tài)性[J]. 刑事技術，2016,41(4):340-344.

10.16467/j.1008-3650.2016.04.021

國家自然科學基金資助項目（81302622）；甘肅省青年科技基金計劃項目（1308RJYA059）；甘肅省公安廳技術研究計劃項目（2016JSYJ01）；河南省科技攻關項目（162102310004）

楊鑫（1982—），男，甘肅蘭州人，碩士，主檢法醫(yī)師，研究方向為法醫(yī)遺傳學。E-mail: lz_yangxin@163.com

* 通訊作者：孫紅兵（1966—），男，甘肅蘭州人，學士，教授/主任法醫(yī)師，研究方向法醫(yī)遺傳學。E-mail: sunhb.good@163.com

胡萌（1980—），女，河南鄭州人，碩士，講師，研究方向法醫(yī)遺傳學。E-mail: humeng310@163.com