電針對多囊卵巢綜合征模型大鼠糖、脂代謝紊亂的影響*

李 威,張益蒴,匡洪影△,馮文婷

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3.山西省太原市第三人民醫(yī)院，山西 太原 030000)

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電針對多囊卵巢綜合征模型大鼠糖、脂代謝紊亂的影響*

李 威1,張益蒴2,匡洪影1△,馮文婷3

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3.山西省太原市第三人民醫(yī)院，山西 太原 030000)

目的：探討電針治療對糖、脂代謝紊亂型多囊卵巢綜合征(PCOS)模型大鼠的療效及影響。方法：24日齡SD大鼠隨機(jī)分組為空白對照組、PCOS模型組、電針治療組，分組后使用雄激素脫氫表雄酮(DHEA)頸背部注射進(jìn)行造模。采用HE染色法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、實(shí)時PCR和WESTENBLOT蛋白印跡進(jìn)行檢測并觀察結(jié)果。結(jié)果：經(jīng)電針治療后卵巢多囊狀態(tài)得到了改善；電針使血清激素LH/FSH比值下降，全身血清脂代謝HLD-C、TG、CHO均降低，LDL升高；電針治療后PCOS模型大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4mRNA的表達(dá)和蛋白水平明顯升高。結(jié)論：電針能夠調(diào)節(jié)PCOS模型大鼠全身糖、脂代謝和卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表達(dá)量和蛋白的含量。

電針;多囊卵巢綜合征;糖、脂代謝

多囊卵巢綜合征(PolycysticOvarySyndrome,PCOS)，是一類異質(zhì)性內(nèi)分泌失調(diào)性疾病，其發(fā)病原因與神經(jīng)內(nèi)分泌、脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝及蛋白質(zhì)代謝等多因素相關(guān)。PCOS的臨床表現(xiàn)主要為月經(jīng)功能紊亂和高雄激素血癥，具體表現(xiàn)包括月經(jīng)失調(diào)、不孕、多毛、痤瘡、肥胖等代謝異常特征。同時PCOS患者患2型糖尿病的風(fēng)險和心血管疾病風(fēng)險的發(fā)生率顯著提高[1]。胰島素抵抗和糖、脂代謝功能障礙存在于雌性PCOS大鼠。此外，存在于卵巢局部組織的異常胰島素信號傳導(dǎo)途徑，可能與調(diào)節(jié)胰島素信號傳導(dǎo)分子的蛋白表達(dá)相關(guān)[2]。近年來，糖、脂代謝紊亂存在于PCOS患者中，針刺作為傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的一部分，應(yīng)用涉及很多領(lǐng)域[3]。

電針(Electroacupuncture,EA)作為一種替代療法得到了廣泛的認(rèn)可，研究發(fā)現(xiàn)電針刺激是一種有前途、有療效的治療多囊卵巢綜合征(PCOS)的方法，為治療多囊卵巢綜合征提供了重要臨床經(jīng)驗(yàn)，增加了知識基礎(chǔ)[4]。研究表明針刺治療多囊卵巢綜合征的療效較好[5]。針刺治療PCOS具有一定優(yōu)勢，與目前處方藥物治療、手術(shù)治療和生活方式相比較，可降低費(fèi)用及多胎妊娠的風(fēng)險[6]。同時針刺治療可適度改善PCOS女性抑郁和焦慮評分，提高相關(guān)健康生活質(zhì)量分?jǐn)?shù)[7]。

針刺治療多囊卵巢綜合征有效，但尚不完全明確，證據(jù)水平也相對較低,需要更多的高質(zhì)量的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究宗旨在于探討電針對于PCOS模型大鼠GLUT1和GLUT4基因表達(dá)量的差異，從而為電針對多囊卵巢綜合征中糖、脂代謝異常型改變提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

21只正常SD健康，清潔級，雌性大鼠(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量(50±5)g，21日齡大小，適應(yīng)性喂養(yǎng)2天飼養(yǎng)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)婦科藥理實(shí)驗(yàn)室。于24日后隨機(jī)分組。隨機(jī)分為空白對照組(CON)、PCOS模型組(PCOS)和電針治療組(EA)。

1.2PCOS模型大鼠的構(gòu)建與評定

構(gòu)建：隨機(jī)分組后PCOS模型組和電針治療組大鼠每日用脫氫表雄酮(DHEA，北京百靈威科技有限公司)60mg/100g體重溶于0.2ml注射藥用級大豆油(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)中，經(jīng)由大鼠頸背部皮下注射，空白對照組的大鼠，作為對照每日注射0.2ml注射藥用級大豆油，連續(xù)注射21日。

評定：造模后每日上午8:00～9:00陰道涂片，然后直接在普通顯微鏡下觀看細(xì)胞的形態(tài)，觀察大鼠的動情周期變化。參照施新猷主編的《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)：動情前期、動情期、動情后期、動情間期。觀察出現(xiàn)連續(xù)的動情周期紊亂說明造模成功。

1.3 電針針刺治療

電針治療組大鼠于造模21日后進(jìn)行針刺治療，選取穴位參照大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜，具體選穴為：子宮、中極、關(guān)元和三陰交穴。1次/天，5天/周，連續(xù)4～5周電針刺激治療。電針針刺治療的第1周15min/次，第2、3周20min/次，第4、5周25min/次。大鼠被固定后，按腧穴定位針刺，針柄連接低頻電針治療儀，連續(xù)波，2Hz電流輸出，以大鼠局部肌肉輕度抖動而不產(chǎn)生掙扎為度，一對導(dǎo)線接同側(cè)兩個穴位。

空白對照組與PCOS模型組大鼠只固定不做任何針刺處理。

1.4 標(biāo)本制備

組織標(biāo)本保存：治療結(jié)束禁食12h后，將處于動情期的大鼠眼眶迅速取血，靜置1h后3500Rpm分離血清，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?；雙側(cè)卵巢經(jīng)稱重后去除表面脂肪組織，一側(cè)卵巢組織固定于10%中性福爾馬林液中，切片后進(jìn)行HE染色，剩余組織置于-70℃冰箱保存。

1.5 檢測方法

血清學(xué)檢測：血清激素FSH、LH等的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(試劑盒購自由武漢云克隆科技股份有限公司)。脂代謝指標(biāo)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科生化組采用酶法測定。

實(shí)時熒光定量RT-PCR(quantitativereal-timePCR)法檢測卵巢組織中GLUT1及GLUT4的表達(dá)水平，實(shí)時熒光試劑選用美國ThermoScientific的BRGreenqpcrMasterMix(2x)ROXsolution，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。引物序列參照NCBI基因庫的基因序列來設(shè)計(jì)引物，該實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段長度為100～250bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

WESTENBLOT蛋白印跡(westernblot)：冷凍保存卵巢組織加入蛋白裂解液后充分破碎，而后12000rpm離心10mins后取上清進(jìn)行定量。蛋白樣品加buffer上樣，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上采用相應(yīng)的一抗及對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育。孵育完成并充分洗脫后，采用放射自顯影的方法檢測目的條帶化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)使用SPSS19.0軟件系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，行正態(tài)性分布檢驗(yàn)后，使用單因素ANOVA均值比較，其中方差齊者使用Bonferroni(B)檢驗(yàn)，不符合者采用Dunnett’sT3(3)檢驗(yàn)，以P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表示組間具有顯著差異性。

2 結(jié)果

2.1 卵巢切片HE染色

由封三彩圖1可見，空白對照組為正常發(fā)育的卵巢卵泡和卵泡顆粒細(xì)胞；PCOS模型組為多囊樣改變，包括囊性擴(kuò)大的卵巢濾泡，黃體與顆粒細(xì)胞層數(shù)減少；電針治療組與PCOS模型組相比黃體顆粒細(xì)胞層數(shù)增加。

2.2 血清激素水平檢測

表1 血清激素FSH與LH及LH/FSH水平

由表1可見，PCOS組與CON組相比較，LH/FSH比值上升，與EA組相比較，LH/FSH比值下降。在血清激素水平上，電針治療組血清激素FSH有所升高，LH有所下降，LH/FSH也有所降低，但未發(fā)現(xiàn)組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 糖脂代謝指標(biāo)

表2 全身血清脂代謝水平的變化

注：與CON比較，*P<0.05；與PCOS比較，#P<0.05

由表2可見，PCOS模型組較空白對照組，高低密度脂蛋白、甘油三酯、膽固醇方面均升高(P<0.05)，針刺治療后高低密度脂蛋白、甘油三酯、膽固醇方面均下降(P<0.05)。

2.4 實(shí)時PCR卵巢局部mRNA表達(dá)量的差異

由表3可見，PCOS模型組大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表達(dá)量升高(P<0.05)，電針治療組大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。

表3 卵巢中GLUT1和GLUT4的mRNA表達(dá)差異

注：與CON比較，*P<0.05；與PCOS比較，#P<0.05

2.5Western-blot中卵巢局部GLUT1與GLUT4的蛋白表達(dá)水平

圖2 卵巢局部GLUT1、GLUT4的蛋白表達(dá)水平

由圖2可見，PCOS模型組大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4蛋白水平下降，電針治療組大鼠經(jīng)過針刺治療后卵巢局部GLUT1、GLUT4蛋白水平明顯升高。但組間比較P>0.05,組間沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

代謝綜合征(Metabolicsyndrome，MS) 是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，主要是指體內(nèi)糖類、脂肪、蛋白質(zhì)這三大營養(yǎng)物質(zhì)或其他多種物質(zhì)發(fā)生異常代謝的病理狀態(tài)。其中PCOS患者最為常見,表現(xiàn)多為糖、脂代謝紊亂[8]。PCOS患者中糖代謝紊亂表現(xiàn)為胰島素抵抗和卵巢局部糖代謝異常；脂代謝紊亂常表現(xiàn)為全血脂代謝異常(TC、TG、LDL-C的水平升高，而HDL-C的水平降低)。

自針刺開始應(yīng)用于PCOS的治療，療效顯著，臨床上針刺治療PCOS收到了很好的療效[9]。研究證明針刺在改善PCOS患者的內(nèi)分泌和代謝紊亂、促排卵和胰島素抵抗等方面都具有良好作用[10]。針刺是通過激活感覺傳入神經(jīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵巢局部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的交感神經(jīng)活動[11]。針刺治療PCOS的理論機(jī)制是通過其自主神經(jīng)系統(tǒng)起作用，針刺使卵巢局部交感標(biāo)記物的表達(dá)和卵巢交感神經(jīng)反射應(yīng)答[12]。本實(shí)驗(yàn)探討了針刺對PCOS治療機(jī)制的進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)選用電針針刺，從根本上調(diào)節(jié)糖、脂代謝紊亂型多囊卵巢綜合征。研究結(jié)果顯示，電針針刺治療后PCOS模型大鼠卵巢的排卵情況得到了恢復(fù)，卵巢多囊改變減少，包括卵巢卵泡，卵泡顆粒細(xì)胞較黃體顆粒細(xì)胞層數(shù)增加；在血清激素水平上，針刺治療后血清激素FSH有所升高，LH有所下降，LH/FSH也有明顯變動；全血脂代謝水平上，電針針刺治療后PCOS模型大鼠的高密度脂蛋白、甘油三酯、膽固醇方面均有所升高；卵巢局部基因表達(dá)和蛋白含量水平上，電針針刺治療后PCOS模型大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表達(dá)量和蛋白水平明顯升高。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUTs)是介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，其中GLUT1(glucosetransporter1)是目前已知體內(nèi)分布最為廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，GLUT1作為機(jī)體分布最廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，不僅與機(jī)體糖代謝疾病有關(guān)，同時與卵巢分泌的性激素有關(guān)，尤其是雌激素[13]。GLUT4 (glucosetransporter4)是循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，是維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素；主要負(fù)責(zé)各類細(xì)胞的基礎(chǔ)糖代謝需求。GLUT4能在胰島素的刺激下，通過易位作用將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，促進(jìn)葡萄糖的攝取和代謝，GLUT4與胰島素抵抗(insulinresistance,IR)密切相關(guān)[14]；同時女性卵巢局部分泌的雌激素也可以調(diào)節(jié)GLUT4的水平。近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)，在倉鼠卵巢細(xì)胞系中特異性激活ERβ可增加GLUT4表達(dá)，雌激素刺激對于GLUT4的相關(guān)表達(dá)影響存在矛盾性[15],說明GLUT4在mRNA的表達(dá)量和蛋白質(zhì)水平均可檢測。

糖、脂代謝紊亂可能對PCOS疾病的發(fā)生具有重要推動作用。電針針刺可以明顯的增加胰島素分泌，達(dá)到降糖作用。這些研究均表明[16-18]，電刺針刺刺激穴位可增加胰島素分泌，降低糖代謝水平；同樣，ShapiraMY等[19]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改善胰島素抵抗降低糖尿病動物模型血糖可通過重復(fù)電針穴位時間達(dá)到。雖然PCOS病因尚未完全闡明，越來越多的研究表明胰島素抵抗IR是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，糖脂代謝紊亂均可引起IR，胰島素抵抗可能是PCOS發(fā)生的主要病理基礎(chǔ),但也有研究持不同的觀點(diǎn)。胰島素抵抗主要是因機(jī)體糖代謝紊亂和脂代謝紊亂造成的。

綜上所述，電針針刺治療對糖脂代謝紊亂型多囊卵巢綜合征改善了卵巢多囊的形態(tài)、全血脂代謝、卵巢局部GLUT1、GLUT4mRNA的表達(dá)和蛋白的含量，由此可見，電針刺激可調(diào)節(jié)PCOS大鼠糖脂代謝紊亂，對于電針治療多囊卵巢綜合征胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

[1]StephenFranksF,HardyK,DumesicDA,etal.PolycysticOvarySyndrome[J].Obstetrics&Gynecology,2004,103(1):181-93

[2] 梁晨，叢晶，?；?，等.補(bǔ)腎化痰復(fù)方對多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)分子的調(diào)控[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011,31(12):1639-1644

[3] 彭艷,李琴華,吳效科,等.電針對多囊卵巢綜合征模型系統(tǒng)的調(diào)控[J].科技導(dǎo)報,2008,26(12):34-42

[4]BillhultA,StenervictorinE.Acupuncturewithmanualandlowfrequencyelectricalstimulationasexperiencedbywomenwithpolycysticovarysyndrome:aqualitativestudy[J].BmcComplementary&AlternativeMedicine,2012,12(12):1-6

[5]MaH,QuanX,LiJ,etal.Acupunctureforpolycysticovarysyndrome:Asystematicreviewandmeta-analysis[C]//IEEEWorkshoponElectronics,ComputerandApplications,2014:800-804

[6]LimDC,XueCC,WongFW,etal.Acupunctureforpolycysticovariansyndrome[J].CochraneDatabaseofSystematicReviews,2011,66(8):CD007689-CD007689

[7]Stener-VictorinE,HolmG,JansonPO,etal.Acupunctureandphysicalexerciseforaffectivesymptomsandhealth-relatedqualityoflifeinpolycysticovarysyndrome:secondaryanalysisfromarandomizedcontrolledtrial[J].BmcComplementary&AlternativeMedicine,2013,13(3):413-416

[8]BoyleJA，CunninqhamJ，NormanRJ，etal.PolycysticovarysyndromeandmetabolicsyndromeinIndigenousAustralianwomen[J].InternMedJ，2015，45(12)：1247-1254

[9] 楊新鳴,于慧佳,付冬雪,等.PCOS病證結(jié)合動物模型及針刺干預(yù)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2016,44(4):101-103

[10]Stener-VictorinE,JedelE,MannerasL.Acupunctureinpolycysticovarysyndrome:currentexperimentalandclinicalevidence[J].JNeuroendocrinology,2008,20(3):290-298

[11]LindeK,StrengA,JürgensS,etal.AcupunctureforPatientsWithMigraine[J].JournaloftheAmericanMedicalAssociation,2005(17):2118-2125

[12]EnblomA,LekanderM,HammarM,etal.Gettingthegriponnonspecifictreatmenteffects:emesisinpatientsrandomizedtoacupunctureorshamcomparedtopatientsreceivingstandardcare[J].PlosOne,2011,6(3):e14766-e14766

[13]Rivenzon-SegalD，Boldin-AdamskyS，SegerD，etal．Glycolysisandglucosetransporter1asmarkersofresponsetohormonaltherapyinbreastcancer[J]．InternationalJournalofCancer，2003，107(2):177-182

[14]Fernandez-VeledoS,HernandezR,TeruelT,etal.CeramidemediatesTNF-alpha-inducedinsulinresistanceonGLUT4geneexpressioninbrownadipocytes[J].ArchPhysiolBiochem,2006,112(1):13-22

[15]LinZ，ShenH，HuangJ，etal．Butyl4-(butyryloxy)benzoatefunctionsasanewselectiveestrogenreceptorbetaagonistandinducesGLUT4expressioninCHO-K1cells[J]．JSteroidBiochemMolBiol，2008，110(1-2):150-156

[16]LinJG，ChangSL，ChengJT．Releaseofβ-endorphinfromadrenalglandtolowerplasmaglucosebyelectroacupunctureatZhongwanacupointinrats[J]．NeurosciLett，2002，326(1):17-20

[17]LinJG，ChenWC，HsiehCL．Multiplesourcesofendogenousopioidpeptideinvolvedinthehypoglycemicresponseto15HzelectroacupunctureatZhongwanacupointinrats[J]．NeurosciLett，2004，366(1):39-42

[18]ChangSL，TsaiCC，LinJG，etal．Involvementofserotonininthehypoglycemicresponseto2HzelectroacupunctureofZusanliacupoint(ST36)inrats[J]．NeurosciLett，2005，379(1):69-73

[19]ShapiraMY，AppelbaumEY，HirshbergB，etal．Asustained，non-insulinrelated，hypoglycaemiceffectofelectroacupunctureindiabeticPsammomysobesus[J]．Diabetologia，2000，43(60):809-813

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,編號：81503610；黑龍江博士后基金項(xiàng)目，編號：061081;哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金項(xiàng)目,編號：RC2015QN003092。

李威(1979-)，男，副研究員，研究方向：生殖內(nèi)分泌代謝。

△通訊作者：匡洪影(1981-)，女，博士后，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)婦科臨床及科研。

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2016-07-17