利用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建耐酸絮凝性產(chǎn)乙醇釀酒酵母

茍敏 楊白雪 湯岳琴 木田建次

（四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065）

利用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建耐酸絮凝性產(chǎn)乙醇釀酒酵母

茍敏 楊白雪 湯岳琴 木田建次

（四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065）

為獲得具有多種優(yōu)良性狀的高效乙醇生產(chǎn)菌株，以絮凝性釀酒酵母RHZ-1及耐酸耐溫釀酒酵母SEB2為親本，通過(guò)紫外誘變獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株，并利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育耐酸絮凝性釀酒酵母。通過(guò)對(duì)融合子的篩選獲得一株優(yōu)秀的耐酸絮凝性釀酒酵母菌株RS-1；該菌株在30℃，pH2.2，15% YPD條件下發(fā)酵24 h，乙醇產(chǎn)生量為47.87 g/L，糖消耗速率和基于糖消耗的乙醇收率分別比親本菌株RHZ-1提高了19.5%和9.8%。在35℃，pH2.2，15% YPD條件下發(fā)酵48 h，乙醇產(chǎn)生量為38 g/L，糖消耗速率和乙醇收率分別比親本菌株RHZ-1提高了46.8%和21.6%。結(jié)果表明，獲得的菌株可為提高燃料乙醇的生產(chǎn)效率奠定基礎(chǔ)。

釀酒酵母；紫外誘變；原生質(zhì)體融合；耐酸性；乙醇發(fā)酵

生物乙醇被認(rèn)為是傳統(tǒng)燃料的重要替代品［1］。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）憑借較高的糖發(fā)酵能力、乙醇耐受性及生物安全性，已成為生產(chǎn)燃料乙醇的首選微生物［2］。大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)常通過(guò)降低發(fā)酵體系的pH值來(lái)控制雜菌污染，但釀酒酵母的最適pH值為4.0-5.0，較低的pH會(huì)影響酵母的生長(zhǎng)及發(fā)酵能力［2］。此外，木質(zhì)纖維素已成為燃料乙醇生產(chǎn)的重要原料。利用其制備燃料乙醇通常包括木質(zhì)纖維素的預(yù)處理、纖維素水解，以及糖類發(fā)酵產(chǎn)乙醇3個(gè)關(guān)鍵步驟［1］。而木質(zhì)纖維素經(jīng)稀酸預(yù)處理后的水解液pH較低，導(dǎo)致后續(xù)過(guò)程中酵母的生長(zhǎng)及發(fā)酵受到抑制［2，3］。調(diào)節(jié)水解液pH值會(huì)增加木質(zhì)纖維素資源化的成本，同時(shí)也易提高發(fā)酵體系遭受外源微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)［4］。選育優(yōu)良的耐酸性釀酒酵母是提高乙醇產(chǎn)量并控制雜菌污染的必然選擇。此外，絮凝性酵母具有的高微生物密度能提高其乙醇耐受性，且易與產(chǎn)物分離的特性更適用于工業(yè)發(fā)酵過(guò)程［5-7］。因此，培育多優(yōu)良性狀的絮凝性釀酒酵母在乙醇工業(yè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

微生物選育的方法包括定向進(jìn)化，基因工程及原生質(zhì)體融合等。酵母的耐酸機(jī)制較為復(fù)雜，目前報(bào)道較多的有質(zhì)子泵、胞內(nèi)堿性物質(zhì)的產(chǎn)生、大分子的保護(hù)和修飾、細(xì)胞膜組分的變化、代謝途徑的改變和其它調(diào)節(jié)因子的作用等［4］。因此，通過(guò)基因工程的手段，如僅改變某個(gè)或某些基因，難以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良耐酸菌株的篩選；依靠選擇壓力下微生物自然變異的定向進(jìn)化技術(shù)又存在耗時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)［8］。針對(duì)機(jī)理尚不明確的微生物育種，源于基因組重組的原生質(zhì)體融合技術(shù)是一種理想方法。它指通過(guò)物理（如電融合）、化學(xué)（如聚乙二醇）或生物（如仙臺(tái)病毒）的誘導(dǎo)作用，將遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程，具有無(wú)需了解控制性狀的機(jī)理及遺傳物質(zhì)交換完整等優(yōu)勢(shì)［9］。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)提高釀酒酵母的性能，多數(shù)研究集中在耐溫高產(chǎn)乙醇菌株的選育，對(duì)耐酸菌的報(bào)道相當(dāng)有限［10］。因此，本研究旨在利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，構(gòu)建具有高效產(chǎn)乙醇能力的耐酸絮凝性釀酒酵母，為乙醇工業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)良的微生物菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株 絮凝性高效產(chǎn)乙醇釀酒酵母RHZ-1及耐酸耐溫釀酒酵母SEB2均由本實(shí)驗(yàn)室選育保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 2% YPD培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母浸出粉10，蛋白胨20；MM培養(yǎng)基（g/L）：無(wú)氨基酵母氮源1.7，酵母粉10，葡萄糖 20，2% YPDU培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨2，硫酸銨1，葡萄糖20；尿嘧啶0.04；15% YPDU培養(yǎng)基：2% YPDU培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為150 g/L。山梨醇高滲再生培養(yǎng)基（YEPDS）：在2% YPD培養(yǎng)基中加入0.9 mol/L山梨醇。在配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入2%的瓊脂粉，所有培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌15 min后使用。

1.1.3 試劑 無(wú)氨基酵母氮源、PEG4000購(gòu)自Sigma公司；山梨醇、巰基乙醇、以及用于營(yíng)養(yǎng)缺陷類型鑒定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)購(gòu)自Amresco公司；Zymolyase-20T購(gòu)自MP Biomedicals公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 紫外誘變選育親本營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株

1.2.1.1 最佳紫外誘變時(shí)間的確定 將菌株RHZ-1及SEB2分別轉(zhuǎn)入2% YPD液體培養(yǎng)基中，30℃活化16 h。菌液經(jīng)無(wú)菌水稀釋后涂布到Y(jié)PD平板上，將平板置于25 W已預(yù)熱過(guò)的紫外燈下20 cm處照射不同時(shí)間后，于30℃靜置培養(yǎng)。通過(guò)比較紫外誘變前后平板長(zhǎng)出的菌落數(shù)，計(jì)算菌株的存活率，以確定最佳的紫外誘變時(shí)間。

1.2.1.2 營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株的篩選 經(jīng)紫外誘變50 s后的親本菌株于30℃靜置培養(yǎng)2 d，將平板長(zhǎng)出的菌落影印至MM平板，30℃過(guò)夜培養(yǎng)。對(duì)比YPD及MM平板長(zhǎng)出的菌落，從YPD平板上挑選出無(wú)法在MM平板生長(zhǎng)的菌落，即營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌。將這些菌株反復(fù)接種到Y(jié)PD及MM平板上培養(yǎng)驗(yàn)證，獲得穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株。隨后將這些菌株涂布到含不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（包括20種天然氨基酸、尿嘧啶、肌醇及腺嘌呤硫酸鹽）的MM平板上，根據(jù)其在平板上的生長(zhǎng)能力，鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷類型。同時(shí)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株進(jìn)行絮凝性，耐酸能力及發(fā)酵性能的評(píng)價(jià)，以獲得最佳的親本營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備與再生 取2個(gè)親本的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株，分別接種至100 mL的2% YPD培養(yǎng)基中，于30℃，160 r/min下培養(yǎng)12 h；將適量培養(yǎng)液裝入50 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min收集菌體；菌體經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗后，加入20 mL 預(yù)處理液（60 mmol/L EDTA-0.1 mol/L磷酸緩沖液和40 μL巰基乙醇），于30℃均勻振動(dòng)30 min，3 000 r/min離心5 min收集菌體；添加20 mL終濃度為0.025 mg/mL的酵母細(xì)胞壁溶解酶（Zymolyase-20T），于30℃輕輕振蕩1.5 h后，3 000 r/min離心5 min收集菌體；加入20 mL的0.6 mol/L KCl-0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗菌體，2 000 r/min離心5 min后收集菌體，并將菌體懸浮于5 mL的0.9 mol/L山梨醇-0.1 mol/L磷酸緩沖液中備用。

原生質(zhì)體形成率及再生率測(cè)定方法如下：取溶解酶處理前的菌懸液，經(jīng)無(wú)菌水稀釋后，涂布在2% YPD平板上，于30℃下培養(yǎng)2 d，記錄酶解前菌落數(shù)（A）；取溶解酶處理后的菌懸液，經(jīng)無(wú)菌水稀釋后涂布到2% YPD平板上，于30℃下培養(yǎng)2 d，記錄未破壁菌落數(shù)（B）；取原生質(zhì)體菌懸液，涂布于YEPDS平板上，在30℃下培養(yǎng)2 d，記錄再生菌落數(shù)（C）；根據(jù)A、B、C值計(jì)算原生質(zhì)體的形成率及再生率。

1.2.3 原生質(zhì)體細(xì)胞的融合 取2個(gè)親本菌株的原生質(zhì)體懸浮液（2×107/mL），按1∶1體積比（各取0.5 mL）混合后放置于1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min收集菌體；加入0.6 mol/L KCl-0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗菌體2次；加入35% PEG4000-50 mmol/L CaCl2溶液，懸浮菌體，并于30℃靜置1 h后，2 000 r/min離心5 min收集菌體；將菌體懸浮于0.6 mol/L KCl-0.1 mol/L磷酸緩沖液中；取懸浮液稀釋后涂布到MM平板上，于30℃培養(yǎng)2-3 d，從長(zhǎng)出的菌落中篩選出同時(shí)具有絮凝性，耐酸能力且發(fā)酵性能最佳的融合子。

1.2.4 菌株的性能評(píng)價(jià)

1.2.4.1 絮凝性評(píng)價(jià) 將菌株接種至2% YPDU培養(yǎng)基（pH自然）中培養(yǎng)16 h。分別取5 mL菌體培養(yǎng)液于試管中，漩渦振蕩均勻，靜置不同時(shí)間后觀察菌株的絮凝性。

1.2.4.2 耐酸能力評(píng)價(jià) （1）絮凝性酵母：取5 mL發(fā)酵液振蕩均勻，取出500 μL，加入適量0.1 mmol/L EDTA打散菌體，再加超純水稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定酵母濃度（OD660）；（2）非絮凝性酵母：將菌株接種至pH3.0和pH2.7的2% YPDU培養(yǎng)基中，并在35℃下于小型試管培養(yǎng)儀（ADVANTEC，日本）中培養(yǎng)，儀器自動(dòng)記錄不同時(shí)間菌體生長(zhǎng)的OD660值。

1.2.4.3 發(fā)酵性能評(píng)價(jià) 將菌株分別接種至2%YPDU培養(yǎng)基（pH自然）中，并于30℃，160 r/min預(yù)培養(yǎng)16 h。再按10%接種量接種至不同pH的15% YPDU培養(yǎng)基中發(fā)酵，定時(shí)取樣檢測(cè)總細(xì)胞數(shù)、葡萄糖濃度和乙醇濃度。菌株的性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5 化學(xué)分析 取5 mL發(fā)酵液于4℃、10 000 r/min條件下離心2 min，上清經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾，用于葡萄糖和乙醇濃度分析。利用LC-10AD VP高效液相色譜儀（Shimadzu，日本）分析葡萄糖濃度，檢測(cè)器為RF-10AXL，爐溫為150℃，柱溫為65℃；利用GC 353B氣相色譜儀（GL sciences，日本）測(cè)定乙醇濃度，以異丙醇為內(nèi)標(biāo)，氦氣為載氣，氫氣為燃?xì)猓瑺t溫為50℃，注射器和檢測(cè)器溫度均為180℃。

2 結(jié)果

2.1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株的篩選

利用紫外誘變的方法獲得親本菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株?？疾炝俗贤庹T變時(shí)間對(duì)菌株存活率的影響。圖1顯示，延長(zhǎng)紫外誘變時(shí)間會(huì)降低菌株的細(xì)胞存活率。一般認(rèn)為細(xì)胞存活率在20%-25%時(shí)獲得的突變菌株比較適合，可以保障菌株性能不受太大影響。因此，確定兩個(gè)親本菌株的最佳紫外誘變時(shí)間均為50 s。在該誘變條件下經(jīng)過(guò)4次反復(fù)篩選驗(yàn)證，最終獲得3株RHZ-1和5株SEB2的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株，每株挑選2個(gè)克隆，分別命名為 RHZ-A1（A2）、RHZ-B1（B2）、RHZ-C1（C2）；SEB-A1（A2）、SEB-B1（B2）、SEB-C1（C2）、SEB-D1（D2）和SEB-E1（E2）。

圖1 紫外誘變時(shí)間的優(yōu)化

將上述16株突變菌株涂布到含不同營(yíng)養(yǎng)物的MM平板上，通過(guò)其生長(zhǎng)能力來(lái)鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷類型（圖2）。RHZ-A1（A2）和SEB-D1（D2）為尿嘧啶缺陷型菌株（Ura-）；RHZ-B1（B2）為賴氨酸缺陷型菌株（Lys-）；RHZ-C1（C2）為半胱氨酸缺陷型菌株（Cys-）；SEB-B1（B2）為腺嘌呤缺陷型菌株（Ade-）；SEB-E1（E2）為組氨酸缺陷型菌株（His-）。而SEB-A1（A2）和SEB-C1（C2）在所有MM平板上均不生長(zhǎng)，表明這4株菌為兩種或多種不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，無(wú)法用于原生質(zhì)體融合的遺傳標(biāo)記篩選，后續(xù)不再對(duì)其進(jìn)行考察。

圖2 親本突變菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷類型鑒定

2.2 營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株的性能評(píng)價(jià)

對(duì)親本RHZ-1的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株進(jìn)行了絮凝性測(cè)試，結(jié)果顯示所有突變菌株都具有良好的絮凝性?？疾炝诉@些菌株在35℃的耐酸能力。如圖3-A所示，在不同pH條件下，菌株RHZ-B1（B2）的生長(zhǎng)能力與親本RHZ-1基本接近；在pH3.0條件下，菌株RHZ-A2的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于親本菌株；酸性條件對(duì)菌株RHZ-C1（C2）的生長(zhǎng)均存在抑制，菌株RHZ-C1的生長(zhǎng)在pH2.7條件下被嚴(yán)重抑制。因此，選擇菌株RHZ-A2、RHZ-B2和RHZ-C2進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)篩選。發(fā)酵結(jié)果（圖4）顯示，菌株RHZ-B2（Lys-）具有較高的發(fā)酵性能，其在細(xì)胞生長(zhǎng)、乙醇產(chǎn)生量、葡萄糖消耗方面，均接近出發(fā)菌株RHZ-1。因此，選擇RHZ-B2（Lys-）作為后續(xù)原生質(zhì)體融合的親本菌株。

以出發(fā)菌株SEB2作為對(duì)照，比較不同pH條件下營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株間的OD660、最大生長(zhǎng)速率μmax（h-1），以及OD660達(dá)到0.5所需時(shí)間tOD660=0.5（min），以判斷各菌株的耐酸能力（圖3-B，C，D）?？梢钥闯?，在pH3.0和pH2.7條件下，只有菌株SEB-E1（E2）的生長(zhǎng)能力接近親本菌株SEB2，其它菌株的生長(zhǎng)均受到一定抑制；當(dāng)pH為2.7時(shí)，抑制情況更加明顯。選擇菌株SEB-B2、SEB-D2、SEB-E2進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)篩選。發(fā)酵結(jié)果（圖4）顯示，SEB-E2（His-）在細(xì)胞生長(zhǎng)、乙醇產(chǎn)生量、葡萄糖消耗方面，均比另外兩個(gè)菌株具有更好的性能。因此，選擇SEB-E2（His-）作為后續(xù)原生質(zhì)體融合的親本菌株。

2.3 原生質(zhì)體細(xì)胞的融合

以菌株RHZ-B2（Lys-）和SEB-E2（His-）作為親本，進(jìn)行原生質(zhì)體細(xì)胞的融合?？疾炝私湍讣?xì)胞壁裂解酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備過(guò)程的影響。如表1所示，受試裂解酶濃度均可獲得100%的原生質(zhì)體形成率，表明酵母細(xì)胞破壁較為理想，但對(duì)再生率的影響較大。酵母裂解酶濃度為0.025 mg/mL時(shí)，菌株RHZ-B2（Lys-）和SEB-E2（His-）可獲得最好的原生質(zhì)體再生率，分別為4.0%和7.5%，有利于下一步融合。

圖3 酸性條件下親本營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的生長(zhǎng)能力評(píng)價(jià)（35℃，2%YPDU）

圖4 親本營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的發(fā)酵能力評(píng)價(jià)（35℃，15% YPDU，pH2.7）

表1 酵母裂解酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

2.4 原生質(zhì)體融合菌株的評(píng)價(jià)

將融合后的菌懸浮液涂布到平板上，對(duì)長(zhǎng)出的融合子進(jìn)行篩選，共獲得16株融合子，命名為RS-1-RS-16?？疾炝巳诤暇甑男跄裕Y(jié)果顯示所有融合菌株RS均具有與親本RHZ-1同等程度的絮凝性。在30℃，pH2.2，15%YPD條件下的發(fā)酵結(jié)果（圖5）顯示，融合菌株RS-1、RS-6及RS-10的葡萄糖消耗速率及乙醇產(chǎn)生量均優(yōu)于親本RHZ-1，其中菌株RS-1的發(fā)酵性能最佳。發(fā)酵24 h時(shí)，菌株RS-1的殘?zhí)橇繛?1.88 g/L［糖消耗速率為4.9 g/（L·h）］，乙醇產(chǎn)生量為47.87 g/L，基于糖消耗的乙醇收率為0.41 g/g；親本RHZ-1殘?zhí)橇繛?2.7 g/L［糖消耗速率為4.1 g/（L·h）］，乙醇產(chǎn)生量為35.93 g/L，基于糖消耗的乙醇收率為0.37 g/g。與RHZ-1相比，RS-1的糖消耗速率和乙醇收率分別提高了19.5%和9.8%。

圖5 30℃條件下融合菌株的發(fā)酵能力評(píng)價(jià)（15% YPDU，pH 2.2）

進(jìn)一步比較了融合菌株在更高溫度（35℃）條件下的發(fā)酵能力。如圖6所示，與親本RHZ-1相比，融合菌株在高溫下的耐酸性能大大提高，菌株RS-1的發(fā)酵性能仍然最佳。發(fā)酵48 h時(shí)，融合菌株RS-1的殘?zhí)橇繛?8.04 g/L［糖消耗速率為2.1 g/（L·h）］，乙醇產(chǎn)生量為38 g/L，基于糖消耗的乙醇收率為0.37 g/g。親本RHZ-1的殘?zhí)橇繛?1.3 g/L［糖消耗速率為1.43 g/（L·h）］，乙醇產(chǎn)生量為20.07 g/L，基于糖消耗的乙醇收率為0.29 g/g。與RHZ-1相比，RS-1的糖消耗速率和乙醇收率分別提高了46.8%和21.6%。因此，本研究以絮凝性菌株RHZ-1和耐酸性菌株SEB2為出發(fā)菌株，通過(guò)原生質(zhì)體細(xì)胞融合，最終獲得一株兼有雙親遺傳性狀，且具有優(yōu)秀乙醇發(fā)酵性能的耐酸絮凝性釀酒酵母菌株RS-1。

圖6 35℃條件下融合菌株的發(fā)酵能力評(píng)價(jià)（15% YPDU，pH 2.2）

3 討論

釀酒酵母是乙醇生產(chǎn)中最常用的發(fā)酵菌株。在實(shí)際的乙醇生產(chǎn)工藝中，木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理以及雜菌污染的控制過(guò)程均會(huì)降低發(fā)酵體系的pH值［4］。如巴西的乙醇生產(chǎn)過(guò)程中，酵母細(xì)胞需經(jīng)pH2.0-2.5的稀硫酸洗滌1-2 h以去除雜菌污染，再返回到發(fā)酵池進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵［11］。但釀酒酵母在低pH值下往往難以維持較高的存活率及發(fā)酵性能，尤其在其它脅迫壓力（如高溫、高糖、高乙醇濃度等）共存時(shí)情況會(huì)更加嚴(yán)峻［12］。因此，同時(shí)擁有多種優(yōu)良性狀的釀酒酵母在提高乙醇產(chǎn)量及降低發(fā)酵成本方面更具有應(yīng)用前景。

釀酒酵母對(duì)環(huán)境壓力的耐受原理非常復(fù)雜，耐酸及耐溫機(jī)制尚不清楚。全基因組表達(dá)分析顯示約2/3的酵母基因參與環(huán)境脅迫的應(yīng)答機(jī)制，且不同菌株之間的響應(yīng)區(qū)別較大［13，14］。因此，傳統(tǒng)的育種技術(shù)如物理化學(xué)突變、原生質(zhì)體融合、基因組改組等更適用于遺傳背景不清楚的工業(yè)酵母的育種，尤其適于多種優(yōu)良性狀菌株的整合。潘靜等［15］利用紫外誘變和3輪原生質(zhì)體融合技術(shù)相結(jié)合的方法，有效選育出能同時(shí)耐受48℃，19% vol乙醇和pH2.6的高產(chǎn)酵母菌株。Mitsumasu等［16］和Benjaphokee等［17］分別利用交配的方法獲得了釀酒酵母二倍體菌株，它們?cè)?1℃、pH3.5條件下的乙醇產(chǎn)量比原始菌株均有提高。關(guān)妮等［18］通過(guò)雙親滅活的原生質(zhì)體融合技術(shù)，獲得一株耐受高濃度乙醇的絮凝性釀酒酵母。但乙醇工業(yè)上真正具有多種優(yōu)良性狀的菌株仍然較少。

本研究以絮凝性釀酒酵母RHZ-1及耐酸耐溫釀酒酵母SEB2為親本，應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)，獲得一株優(yōu)秀的耐酸絮凝性釀酒酵母菌株RS-1。由于現(xiàn)有研究多采用不同選育方法獲得有機(jī)酸耐受釀酒酵母（如甲酸、乙酸等），而對(duì)耐受低pH無(wú)機(jī)酸的相關(guān)報(bào)道有限，因此可用于與本研究獲得的菌株進(jìn)行比較的同類菌株很少［19］。Ortiz-Mu?iz等［20］從糖蜜發(fā)酵液中分離出性能優(yōu)良的野生菌株ITV-01，在30℃、pH2.5條件下利用15% YPD發(fā)酵，發(fā)酵36 h后殘?zhí)橇繛?2.2 g/L，乙醇收率為0.39 g/g。而本研究獲得的菌株RS-1，在30℃、pH2.2條件下利用15% YPD發(fā)酵，24 h后的殘?zhí)橇績(jī)H為31.88 g/L，乙醇收率為0.41 g/g。且菌株ITV-01在溫度高于35℃、pH低于3.5的條件下難以生長(zhǎng)，表明其無(wú)法耐受高溫及低pH值的協(xié)同壓力。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)逐步降低發(fā)酵體系pH長(zhǎng)期馴化的方式，獲得了一株耐酸性能優(yōu)良的釀酒酵母SCiK12-BC4［21］。在35℃，pH2.5條件下利用15%YPD發(fā)酵48 h后，SCiK12-BC4基于糖消耗的乙醇收率（0.41 g/g）與菌株RS-1（35℃，pH2.2，0.37 g/g）接近。但整個(gè)過(guò)程耗時(shí)，工作量大，且耐酸能力不如菌株RS-1。原生質(zhì)體融合技術(shù)具有在較短周期內(nèi)選育優(yōu)良菌株的優(yōu)勢(shì)。對(duì)融合菌株RS-1進(jìn)行了長(zhǎng)期反復(fù)傳代培養(yǎng)（傳代34次），驗(yàn)證了其耐酸性能的穩(wěn)定性。此外，杜昭勵(lì)等［22］發(fā)現(xiàn)絮凝基因FLO1 及FLO1c 的高表達(dá)可有效提高工業(yè)釀酒酵母的乙酸耐受性及發(fā)酵性能。因此，今后將進(jìn)一步探索以提高菌株RS-1的耐乙酸及耐溫性能，為燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)秀的多耐性微生物菌株資源。

4 結(jié)論

以絮凝性釀酒酵母RHZ-1及耐酸耐溫釀酒酵母SEB2為親本，通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出一株優(yōu)秀的耐酸絮凝性釀酒酵母RS-1。發(fā)酵結(jié)果顯示，菌株RS-1在30℃及35℃的酸性條件下（pH2.2），均能高效發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇，且該菌株的糖消耗速率和基于糖消耗的乙醇收率均比親本菌株RHZ-1有較大提高。結(jié)果表明原生質(zhì)體融合技術(shù)是快速獲得耐酸絮凝性釀酒酵母的有效手段。

［1］ Morales M, Quintero J, Conejeros R, et al. Life cycle assessment of lignocellulosic bioethanol：Environmental impacts and energy balance［J］. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2015, 42：1349-1361.

［2］ Madhavan A, Srivastava A, Kondo A, et al. Bioconversion of lignocellulose-derived sugars to ethanol by engineered Saccharomyces cerevisiae［J］. Critical Reviews in Biotechnology, 2012, 32（1）：22-48.

［3］ Carrere H, Antonopoulou G, Affes R, et al. Review of feedstock pretreatment strategies for improved anaerobic digestion：From lab-scale research to full-scale application［J］. Bioresource Technology, 2016, 199：386-397.

［4］ Cotter PD, Hill C. Surviving the acid test：Responses of gram-positive bacteria to low pH［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003, 67（3）：429-453.

［5］ Choi GW, Um HJ, Kang HW, et al. Bioethanol production by a flocculent hybrid, CHFY0321 obtained by protoplast fusion between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus［J］. Biomass and Bioenergy, 2010, 34（8）：1232-1242.

［6］ Zhao XQ, Bai FW. Yeast flocculation：New story in fuel ethanol production［J］. Biotechnology Advances, 2009, 27（6）：849-856.

［7］ 胡純鏗, 白鳳武, 安利佳. 絮凝特性對(duì)自絮凝顆粒酵母耐酒精能力的影響及作用機(jī)制［J］. 生物工程學(xué)報(bào), 2005, 21（1）：123-128.

［8］ 鞏繼賢, 鄭輝杰, 鄭宗寶, 等. 微生物進(jìn)化工程育種技術(shù)進(jìn)展與展望［J］. 生物加工過(guò)程, 2010, 8（2）：69-76.

［9］ 趙春苗, 徐春厚. 原生質(zhì)體融合技術(shù)及在微生物育種中的應(yīng)用［J］. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2012, 24（4）：379-382.

［10］ 葉世超, 薛婷, 王曉斐, 等. 釀酒酵母耐高溫提高技術(shù)的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013, 29（21）：126-130.

［11］ Bassi AP, da Silva JC, Reis VR, et al. Effects of single and combined cell treatments based on low pH and high concentrations of ethanol on the growth and fermentation of Dekkera bruxellensis and Saccharomyces cerevisiae［J］. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2013, 29（9）：1661-1676.

［12］ de Melo HF, Bonini BM, Thevelein J, et al. Physiological and molecular analysis of the stress response of Saccharomyces cerevisiae imposed by strong inorganic acid with implication to industrial fermentations［J］. Journal of Applied Microbiology, 2010, 109（1）：116-127.

［13］ Causton HC, Ren B, Koh SS, et al. Remodeling of yeast genome expression in response to environmental changes［J］. Molecular Biology of the Cell, 2001, 12（2）：323-337.

［14］ Garay-Arroyo A, Covarrubias AA, Clark I, et al. Response to different environmental stress conditions of industrial and laboratory Saccharomyces cerevisiae strains［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003, 63（6）：734-741.

［15］ 潘靜, 王昌祿, 李風(fēng)娟, 等. 多耐性酒精酵母菌的選育及特性研究［J］. 中國(guó)釀造, 2011, 30（5）：113-116.

［16］ Mitsumasu K, Liu ZS, Tang YQ, et al. Development of industrial yeast strain with improved acid- and thermo-tolerance through evolution under continuous fermentation conditions followed by haploidization and mating［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2014, 118（6）：689-695.

［17］ Benjaphokee S, Hasegawa D, Yokota D, et al. Highly efficientbioethanol production by a Saccharomyces cerevisiae strain with multiple stress tolerance to high temperature, acid and ethanol［J］. New Biotechnology, 2012, 29（3）：379-386.

［18］ 關(guān)妮, 楊登峰, 米慧芝, 等. 多優(yōu)良性狀工業(yè)化釀酒酵母的選育及其特性研究［J］. 中國(guó)釀造, 2010, 29（9）：45-48.

［19］ Sanda T, Hasunuma T. Repeated-batch fermentation of lignocellulosic hydrolysate to ethanol using a hybrid Saccharomyces cerevisiae strain metabolically engineered for tolerance to acetic and formic acids［J］. Bioresource Technology, 2011, 102（17）：7917-7924.

［20］ Ortiz-Mu?iz B, Carvajal-Zarrabal O, Torrestiana-Sanchez B, et al. Kinetic study on ethanol production using Saccharomyces cerevisiae ITV-01 yeast isolated from sugar cane molasses［J］. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2010, 85（10）：1361-1367.

［21］ 羅珠, 湯岳琴, 孫照勇, 等. 基于連續(xù)發(fā)酵馴化的耐酸性釀酒酵母的育種［J］. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2014, 51（4）：821-828.

［22］ 杜昭勵(lì), 程艷飛, 朱卉, 等. 絮凝基因FLO1及FLO1c高表達(dá)提高工業(yè)釀酒酵母乙酸耐受性及發(fā)酵性能［J］. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31（2）：231-241.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction of Acid-tolerant and Flocculating Saccharomyces cerevisiae Strain for Ethanol Production by Protoplast Fusion

GOU Min YANG Bai-xue TANG Yue-qin Kida Kenji
（Sichuan University，College of Architecture and Environment，Chengdu 610065）

In order to obtain an excellent strain with multi traits for ethanol production，using flocculating strain RHZ-1 and acid-tolerant strain SEB2 as the parents，auxotrophic strains were obtained by UV mutagenesis induction. Saccharomyces cerevisiae strain RS-1 with excellent acid-tolerant and flocculating ability was selected by screening fusants with the technology of protoplast fusion. When fermenting 15% YPD at 30℃ and pH2.2 for 24 h，the ethanol yield was 47.87 g/L，the glucose consumption rate and ethanol yield of strain RS-1 was greatly improved compared to the original strain RHZ-1，increased 19.5% and 9.8%，respectively. When fermenting 15% YPD at 35℃ and pH2.2 for 48 h，the ethanol yield was 38 g/L，the glucose consumption rate and ethanol yield of strain RS-1 increased 46.8% and 21.6%，respectively compared to the original strain RHZ-1. The results suggest that the strain obtained in this study could be a potential microorganism for ethanol industry.

Saccharomyces cerevisiae；UV mutagenesis；protoplast fusion；acid tolerance；ethanol fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.013

2016-03-30

茍敏，女，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：有機(jī)廢棄物資源化；E-mail：gouminscu@163.com

湯岳琴，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：有機(jī)廢棄物資源化；E-mail：tangyq@scu.edu.cn