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    產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株S68-CM5產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究

    2016-12-21 02:54:36胡基華曹旭2孟力強(qiáng)2陳靜宇姜威2劉宇帥2張淑梅2李晶
    生物技術(shù)通報(bào) 2016年11期
    關(guān)鍵詞:沙雷氏幾丁質(zhì)產(chǎn)酶

    胡基華曹旭,2孟力強(qiáng),2陳靜宇姜威,2劉宇帥,2張淑梅,2李晶,2

    (1. 黑龍江省科學(xué)院微生物研究所,哈爾濱 150010;2. 黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院,哈爾濱 150010)

    產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株S68-CM5產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究

    胡基華1曹旭1,2孟力強(qiáng)1,2陳靜宇1姜威1,2劉宇帥1,2張淑梅1,2李晶1,2

    (1. 黑龍江省科學(xué)院微生物研究所,哈爾濱 150010;2. 黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院,哈爾濱 150010)

    為提高黏質(zhì)沙雷氏菌株S68-CM5產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力,對產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究。利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行摸索。結(jié)果顯示,獲得最佳發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基:膠體幾丁質(zhì)1.5%,牛肉膏7 g/L,酵母膏2 g/L,葡萄糖8 g/L,氯化鈉 3.5 g/L,蛋白胨2 g/L,磷酸氫二鉀3.5 g/L;最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為:pH6.88,溫度27.32℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)155.82 r/min,培養(yǎng)時(shí)間60 h,接種量1%,裝液量50 mL/250 mL。優(yōu)化后產(chǎn)酶量達(dá)到7.131 U/mL,比優(yōu)化前產(chǎn)酶量提高了1.43倍。

    黏質(zhì)沙雷氏菌;培養(yǎng)基優(yōu)化;響應(yīng)面

    黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)亦稱靈桿菌,是革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌,屬于腸桿菌科克白雷氏菌族中的沙雷氏菌屬。在培養(yǎng)過程中,能產(chǎn)生紅色非擴(kuò)散性色素-靈菌紅素(Prodigiosin)和幾丁質(zhì)酶(Chitinase EC.3.2.14)[1],幾丁質(zhì)酶專一性水解幾丁質(zhì)中的β-1,4糖苷鍵,轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生菌體蛋白和氨基寡糖等產(chǎn)物,具有降解幾丁質(zhì)的功能。到目前為止,已在細(xì)菌、放線菌、真菌中檢測到幾丁質(zhì)酶,并且應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、化妝和動(dòng)物飼料等行業(yè),在害蟲防治中具有增效作用[2]。已有研究表明黏質(zhì)沙雷氏菌是一類幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生能力較強(qiáng)的細(xì)菌,是幾丁質(zhì)酶最好的來源之一。但由于幾丁質(zhì)酶的多樣性,調(diào)控機(jī)理的復(fù)雜性,以及菌株產(chǎn)酶能力低下、發(fā)酵工藝不成熟等原因,真正應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的并不多見。因此,獲得其最佳產(chǎn)酶條件是微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶研究的重要任務(wù)。

    本研究是基于對本實(shí)驗(yàn)室自有菌株黏質(zhì)沙雷氏菌S68誘變基礎(chǔ)上,獲得產(chǎn)酶量高的新菌株S68-CM5的后續(xù)研究,利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),對幾丁質(zhì)酶的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,旨為黏質(zhì)沙雷氏菌液深層發(fā)酵和生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶新型植物保護(hù)劑奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種 黑龍江省科學(xué)院微生物研究所生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)誘變黏質(zhì)沙雷氏菌株S68-CM5。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    1.1.2.1 斜面培養(yǎng)基 葡萄糖5 g/L,牛肉膏1.5 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L,NaCl 3.5 g/L,K2HPO43.65 g/L,瓊脂15 g/L,初始pH為7.0-7.5。

    1.1.2.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖5 g/L,牛肉膏1.5 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L,NaCl 3.5 g/L,K2HPO43.65 g/L,初始pH為7.0-7.5。

    1.1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖5 g/L,牛肉膏1.5 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L,NaCl 3.5 g/L,K2HPO43.65 g/L,1%質(zhì)量百分比膠體幾丁質(zhì)以10%濃度加入培養(yǎng)基中,初始pH為7.0-7.5。

    培養(yǎng)基滅菌條件均為濕熱滅菌121℃,20 min。

    1.2 方法

    1.2.1 種子培養(yǎng)

    1.2.1.1 種子活化 將黏質(zhì)沙雷氏菌種S68-CM5轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)24 h。

    1.2.1.2 種子培養(yǎng) 挑一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的菌株接種于5 mL試管種子培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng) 150 r/min培養(yǎng)16 h。

    1.2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液以1%接種量接種于250 mL裝三角瓶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,三角瓶裝液量為50 mL,30℃培養(yǎng)150 r/min培養(yǎng)60 h。

    1.2.2 酶活力測定 將培養(yǎng)60 h的菌液離心(7 000 r/min,-4℃,30 min)取上清液,以35%濃度使用硫酸銨進(jìn)行蛋白沉淀,24 h后離心(7 000 r/min,-4℃,30 min)留取上清液,再以75%濃度硫酸銨沉淀蛋白,24 h后離心(8 000 r/min,-4℃,30 min),取沉淀物使用半透膜(MW7000)用流動(dòng)水除鹽8 h;使用聚乙二醇6000濃縮至1 mL左右;取0.4 mL樣品,0.4 mL蒸餾水空白對照,分別加入0.4 mL濃度為0.05 mol/L醋酸液,0.4 mL 1%膠體幾丁質(zhì)37℃水浴(2 h)降解幾丁質(zhì)成單糖;離心(4 000 r/min,4℃,10 min)取0.4 mL上清液加入40 μL質(zhì)量百分比為1%蝸牛酶水?。?7℃,30 min),加入0.2 mL飽和硼砂緩沖;干式恒溫器100℃,7 min,冷卻再加入2 mL冰醋酸和1 mL濃度1% DMAB水浴(37℃,15 min)進(jìn)行顯色反應(yīng),585 nm測吸光度。根據(jù)N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力[3]。酶活力單位(U)表示在上述反應(yīng)條件下,每1 min時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生1 μmol NAG所需要的酶量。

    1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的顯著因子篩選

    1.2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Plackett-Burman進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),篩選7個(gè)組分:葡萄糖(A)、牛肉膏(B)、蛋白胨(D)、酵母膏(E)、NaCl(G)、K2HPO4(H)和膠體幾丁質(zhì)(J),選用10因子2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì),增加3個(gè)空白項(xiàng)C、F、I來估計(jì)試驗(yàn)誤差,每個(gè)因子取高低2個(gè)水平,且高水平是低水平的2倍(表1)。

    1.2.3.2 爬坡試驗(yàn) 通過對Plackett-Burman設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,確定主要因子,根據(jù)回歸方程各因子的系數(shù)來確定主要因子的爬坡路徑和步長[4]。改變各主要因子在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度,使其成梯度變化,檢測各個(gè)梯度下菌株的酶活,快速確定最大響應(yīng)值的區(qū)域。

    1.2.4 響應(yīng)面方法對培養(yǎng)條件試驗(yàn)

    1.2.4.1 培養(yǎng)條件各因素篩選 采用Plackett-Burman進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),篩選的6個(gè)因素分別是pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)、培養(yǎng)時(shí)間和裝液量,選用10因子2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì),增加3個(gè)空白項(xiàng)C、F、I來估計(jì)試驗(yàn)誤差,每個(gè)因子取高低兩個(gè)水平(表2)。

    1.2.4.2 Plackett-Burman主要因子 確定影響SM68-CM5菌株產(chǎn)酶條件的3個(gè)主要因素,爬坡試驗(yàn)確定3個(gè)主要因子響應(yīng)區(qū)域,采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理在主要因子的響應(yīng)區(qū)各取3個(gè)水平,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

    表1 Plackett-Burman分析碳源、氮源與水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    表2 Plackett-Burman分析培養(yǎng)條件優(yōu)化因素與水平

    1.2.5 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)處理包含3個(gè)平行試驗(yàn),取值為3個(gè)平行試驗(yàn)的均值。Plackett-Burman設(shè)計(jì)采用Minitab 16軟件完成,Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析由Design-Expert8.0.6.1完成。

    2 結(jié)果

    2.1 黏質(zhì)沙雷氏菌S68-CM5產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

    2.1.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選培養(yǎng)基碳氮源顯著因子 采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)對膠體幾丁質(zhì)、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaCl和K2HPO4

    7個(gè)因素每個(gè)組分取高水平(+1)和低水平(-1),

    各因子所代表的高低水平和方差分析結(jié)果,見表3。由表4中P值的大小可以判定,培養(yǎng)基中各因子對S68-CM5菌株酶活影響,膠體幾丁質(zhì)P值為0.003,J>B>E>A>G>D>H,即膠體幾丁質(zhì)>牛肉膏>酵母膏>葡萄糖>氯化鈉>蛋白胨>磷酸氫二鉀。效應(yīng)關(guān)系用方程式表示為:W=4.25+X1+0.87X3+ 2.4X4,方程R2=0.9021,表明該回歸方程擬合良好。從方程中還可以看出,要提高菌體數(shù)量,應(yīng)提高膠體幾丁質(zhì)、葡萄糖和牛肉膏添加量。

    表3 Placket-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)值

    表4 Placket-Burman設(shè)計(jì)顯著因子分析

    2.1.2 最陡爬坡試驗(yàn)研究最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域 根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選出的主要組分的效應(yīng)大小設(shè)計(jì)它們的步長,進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì),尋找產(chǎn)酶量最高的濃度。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示,最佳菌體數(shù)量在試驗(yàn)號(hào)3附近。

    確定了顯著因子的最適濃度區(qū)域之后,即以1.5%膠體幾丁質(zhì),牛肉膏7 g/L,酵母膏2 g/L,各因素代碼和水平設(shè)計(jì),見表5。

    2.2 黏質(zhì)沙雷氏菌S68-CM5產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

    2.2.1 Plackett-Burman篩選顯著因子 采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對主要6個(gè)培養(yǎng)因素進(jìn)行分析。每個(gè)因素取高水平(+1)和低水平(-1),各因子所代表的高低水平和方差分析結(jié)果,見表6。

    表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    表6 Placket-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)值

    由表7中P值的大小可以判定,培養(yǎng)條件各因子對S68-UM5菌株酶活影響,pH0.011,搖床轉(zhuǎn)速0.015,培養(yǎng)溫度0.021,A>D>E>G>B>H,即pH>搖床轉(zhuǎn)數(shù)>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時(shí)間>接種量>裝液量。顯然,pH、搖床轉(zhuǎn)數(shù)和培養(yǎng)溫度的影響較為突出。

    表7 Placket-Burman設(shè)計(jì)顯著因子分析

    2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表8,確定了影響酶活最顯著3個(gè)因子為pH值、溫度和搖床轉(zhuǎn)數(shù)。以pH7.0,溫度28℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)150 r/min為中心點(diǎn),設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),每個(gè)處理設(shè)定3個(gè)重復(fù)試驗(yàn),以酶活為響應(yīng)值。

    表8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

    方差分析結(jié)果表明,該模型的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對酶活的影響均顯著,而交互作用酶活的影響不顯著,回歸模型的P值0.037 2,表明模型是顯著的,而失擬項(xiàng)的P值為0.159 1,失擬不顯著;模型的決定系數(shù)R2=0.910 7,說明模型達(dá)到較好的擬合程序,經(jīng)分析軟件回歸擬合得到該模型的回歸方程:酶 活=0.65-0.14A-0.24B+0.17C+7.500E-003AB-0.075AC+0.40BC-0.34A2-0.37B2-0.25C2。

    為解得該同回歸方程的極值點(diǎn),對其各自變量分別求一階偏導(dǎo),得到三元一次方程組,解出該模型的極值點(diǎn),從而計(jì)算出對應(yīng)因素的取值:pH6.88,溫度27.32℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)155.82 r/min,此時(shí)模型的理論最高酶活為7.092 U/mL。

    根據(jù)擬合回歸方程采用Design-Expert8.0.6.1分析,繪出主要因素相應(yīng)的等高線和響應(yīng)面分析圖(圖1-圖3)。每個(gè)響應(yīng)面可反映出兩個(gè)主要因素之間的相互作用,3個(gè)因素固定在最優(yōu)值不變的情況下,隨著另外2個(gè)因素的逐漸增加,酶活呈先增后減的趨勢,而曲面的頂點(diǎn)即為酶活的最大值點(diǎn)[5]。

    2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

    根據(jù)分析(表5和表8)結(jié)果,鑒于實(shí)驗(yàn)室條件,實(shí)際設(shè)定值為:pH7,溫度28℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)155 r/min,培養(yǎng)時(shí)間60 h,接種量1%,裝液量50mL/250 mL。為了驗(yàn)證這一結(jié)果的有效性,按照上述分析結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),檢測結(jié)果為7.131 U/mL,與預(yù)測值相近,說明該模型擬合的有效性。

    圖1 pH值和溫度交互作用對酶活影響的等高線(A)和響應(yīng)面(B)

    圖2 pH值和搖床轉(zhuǎn)數(shù)交互作用對酶活影響的等高線(A)和響應(yīng)面(B)

    圖3 溫度和搖床轉(zhuǎn)數(shù)交互作用對酶活影響的等高線(A)和響應(yīng)面(B)

    3 討論

    Plackett-Burman設(shè)計(jì)是一種以不完全平衡塊(Balanced incomplete blocks)為原理的部分因子設(shè)計(jì)法[6,7],具有試驗(yàn)次數(shù)少效率高的特點(diǎn),Wu和陳寧等[8,9]都利用PB設(shè)計(jì)通過12次試驗(yàn),從10種成分中快速篩選出主要影響發(fā)酵產(chǎn)酸的成分。目前國內(nèi)外許多研究都采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對不同微生物培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,均獲得較為理想的結(jié)果[10,11]。

    碳源是影響微生物發(fā)酵的最主要因素之一,本研究發(fā)現(xiàn)膠體幾丁質(zhì)是誘導(dǎo)S68-CM5產(chǎn)幾丁質(zhì)酶主要的碳源,這與大多數(shù)幾丁質(zhì)酶為誘導(dǎo)酶有關(guān)[12],幾丁質(zhì)濃度在1.5%時(shí)酶活5.29 U/mL,膠體幾體質(zhì)濃度高的情況下酶活反而下降,可能是由于幾丁質(zhì)濃度高,黏稠度低利于酶產(chǎn)生。葡萄糖作為碳源時(shí)不利于幾丁質(zhì)酶分泌,與王海東[13]研究的SWCH-6菌株及楊紹青[14]研究的一株高溫紫鏈霉菌結(jié)果相似。常用氮源中牛肉膏和酵母膏對產(chǎn)酶有影響。

    通過PB從7個(gè)因素篩選出3個(gè)影響產(chǎn)酶的主要因素,利用響應(yīng)面分析法Box-Behnken設(shè)計(jì)確定顯著因子最優(yōu)配比:pH6.88,溫度27.32℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)155.82 r/min。幾丁質(zhì)酶最適催化pH范圍較廣,一般在3.0-11.0之間,大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶最適催化在pH4.0-6.0的偏酸環(huán)境,在已有的研究中SWCH-6的最適pH值為5.0,本研究菌株S68-CM5的最佳pH值6.88,具有一般幾丁質(zhì)酶的特點(diǎn)。從產(chǎn)酶的歷程看,S68-CM5從48 h開始分泌幾丁質(zhì)酶,在60 h時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶高峰,與以往文獻(xiàn)報(bào)道幾丁質(zhì)酶活力高峰一般出現(xiàn)在4-8 d相比[14,15],產(chǎn)酶時(shí)間提前,提高了產(chǎn)酶效率。

    目前,多種統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法已被成功地運(yùn)用于微生物培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化工作中,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定了誘變菌株S68-CM5培養(yǎng)基碳、氮源和最佳產(chǎn)酶條件,尋找合適的發(fā)酵工藝、探索使酶活穩(wěn)定的方法,從而推動(dòng)幾丁質(zhì)研究及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。下一步打算在此研究的基礎(chǔ)上對S68-CM5菌株進(jìn)行中試研究,利用20 L自控罐研究黏質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5發(fā)酵條件,探討誘導(dǎo)底物、底物濃度及添加時(shí)間對產(chǎn)酶量的影響;優(yōu)化幾丁質(zhì)酶的提取和純化工藝,提高酶的收率。

    4 結(jié)論

    得到黏質(zhì)沙雷氏菌S68-CM5最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基:膠體幾丁質(zhì)1.5%,牛肉膏7 g/L,酵母膏2 g/L,葡萄糖8 g/L,氯化鈉 3.5 g/L,蛋白胨2 g/L,磷酸氫二鉀3.5 g/L;最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件:pH6.88,溫度27.32℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)155.82 r/min,培養(yǎng)時(shí)間60 h,接種量1%,裝液量50 mL/250 mL,優(yōu)化后產(chǎn)酶量達(dá)到7.131 U/mL。

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    (責(zé)任編輯 狄艷紅)

    Optimizing the Enzyme-producing Conditions of Chitinase-producing Strain S68-CM5

    HU Ji-hua1CAO Xu1,2MENG Li-qiang1,2CHEN Jing-yu1JIANG Wei1,2LIU Yu-shuai1,2ZHANG Shu-mei1,2LI Jing1,2
    (1. Institute of Microbiology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150010;2. Institute of Advanced Technology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150010)

    In order to improve the capacity of Serratia marcescens strain S68-CM5 producing chitinase,the fermentation conditions of enzyme production were optimized. Using Plackett-Burman design and response surface method,the conditions of medium and fermentation were explored. The results showed that the optimal enzyme production medium:1.5% colloidal chitin,beef extract 7 g/L,yeast extract 2 g/L,glucose 8 g/L,NaCl 3.5 g/L,peptone 2 g/L,and hydrogen phosphate dehydrate potassium 3.5 g/L;the optimal culture conditions for enzyme production:pH6.88,temperature 27.32℃,shakers revolutions 155.82 r/min,incubation time 60 h,and inoculums size 1% liquid volume 50 mL/250 mL. After optimization,the enzyme production reached 7.131 U/mL,and 1.43 folds of that before optimization.

    Serratia marcescens;medium optimization;response surface

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.027

    2016-03-20

    黑龍江省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究專項(xiàng)課題,黑龍江省科學(xué)院學(xué)科團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新能力提升專項(xiàng)(2014ws09)

    胡基華,女,副研究員,研究方向:生物防治;E-mail:158631375@qq.com

    李晶,女,研究員,研究方向:農(nóng)業(yè)微生物;E-mail:lijing0706@sohu.com

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