厭氧消化過程穩(wěn)定性與微生物群落的相關(guān)性

李 蕾,何 琴,馬 垚,趙小飛,瞿 莉,王小銘,彭緒亞(重慶大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400045)

厭氧消化過程穩(wěn)定性與微生物群落的相關(guān)性

李 蕾,何 琴,馬 垚,趙小飛,瞿 莉,王小銘,彭緒亞*(重慶大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400045)

為探析厭氧消化過程穩(wěn)定性與微生物群落的相關(guān)性,在餐廚垃圾厭氧消化反應(yīng)器中引入負(fù)荷擾動(dòng)以誘導(dǎo)不同的運(yùn)行狀態(tài),理化分析和高通量測(cè)序相結(jié)合用于研究各個(gè)狀態(tài)下的狀態(tài)參數(shù)響應(yīng)及微生物群落動(dòng)態(tài).結(jié)果表明,均衡的群落結(jié)構(gòu)保證了反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行,穩(wěn)定狀態(tài)下反應(yīng)器的甲烷產(chǎn)率和揮發(fā)性固體(VS)去除率分別高達(dá)(0.50±0.01) LC H4/gVS和(89.58±0.08)%.高負(fù)荷下產(chǎn)酸細(xì)菌(柔膜菌門、放線菌門)大量增殖,誘導(dǎo)互養(yǎng)脂肪酸降解菌(梭菌綱)的相對(duì)豐度劇增,然而與之互營(yíng)的氫型產(chǎn)甲烷菌的豐度和活性卻下降了.產(chǎn)甲烷菌與互養(yǎng)脂肪酸降解菌的失衡導(dǎo)致它們不能有效的互養(yǎng)合作,從而引起揮發(fā)性脂肪酸(VFA)積累和過程失穩(wěn).積累的VFA和氨使比乙酸產(chǎn)甲烷活性(SAMA)和比產(chǎn)甲烷活性(SMA)分別下降 60.12%和 72.51%,進(jìn)一步加劇了過程失穩(wěn).擾動(dòng)停止后,盡管反應(yīng)器恢復(fù)了原有運(yùn)行條件和性能,但微生物群落達(dá)到了新的平衡.

餐廚垃圾；厭氧消化；過程穩(wěn)定性；微生物群落；454高通量測(cè)序

我國(guó)餐廚垃圾產(chǎn)量逐年增加,處置不當(dāng)會(huì)引發(fā)一系列環(huán)境衛(wèi)生和食品安全問題.厭氧消化(AD)技術(shù)能在處理廢物的同時(shí)回收能源,被廣泛用于餐廚垃圾處理[1-2].然而AD系統(tǒng)在運(yùn)行過程中易發(fā)生抑制、酸化、起泡等“過程不穩(wěn)定”現(xiàn)象,在高負(fù)荷下運(yùn)行時(shí)尤其顯著[3-5].鑒于AD系統(tǒng)是以微生物為主導(dǎo)的生化反應(yīng)過程,研究微生物群落有助于優(yōu)化系統(tǒng)性能,保證過程穩(wěn)定性[6-9].近年來國(guó)內(nèi)外很多研究探索了 AD系統(tǒng)中的微生

物群落,但大多只考慮了某一運(yùn)行狀態(tài)下系統(tǒng)中的群落組成或其隨時(shí)間的演替[10-12].也有研究者將負(fù)荷擾動(dòng)與微生物群落結(jié)合,但通常僅考慮了穩(wěn)定運(yùn)行階段下微生物群落隨負(fù)荷的演替[5,13].少量研究考慮了負(fù)荷擾動(dòng)下穩(wěn)定和失穩(wěn)兩種運(yùn)行狀態(tài)下的微生物群落動(dòng)態(tài).如 Polag等[14]研究了負(fù)荷高度波動(dòng)的全規(guī)模反應(yīng)器內(nèi)總細(xì)菌、總古菌、甲烷八疊球菌科、甲烷鬃菌科等微生物的數(shù)量在不同運(yùn)行階段的變化.Goux等[4]在甜菜漿厭氧消化系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)超負(fù)荷酸化后甲烷鬃菌被甲烷囊菌取代,乙酸型產(chǎn)甲烷途徑向氫型產(chǎn)甲烷轉(zhuǎn)移;細(xì)菌在擾動(dòng)后也達(dá)到了新的平衡.Razaviarani等[15]研究了污水污泥與餐廚廢油聯(lián)合厭氧消化反應(yīng)器在穩(wěn)定和超負(fù)荷兩個(gè)運(yùn)行階段下的微生物群落動(dòng)態(tài),發(fā)現(xiàn)兩種狀態(tài)下主導(dǎo)甲烷菌不同,且超負(fù)荷后pH、堿度、甲烷含量下降,VFA急劇上升.可見現(xiàn)有文獻(xiàn)主要研究不同運(yùn)行狀態(tài)下 AD系統(tǒng)的狀態(tài)參數(shù)響應(yīng)及微生物群落動(dòng)態(tài),甚至只關(guān)注了不同狀態(tài)下主導(dǎo)細(xì)菌或古菌的演替,鮮有人探析微生物的演替為什么會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)失穩(wěn),微生物群落結(jié)構(gòu)和 AD過程穩(wěn)定性之間有怎樣的相關(guān)性.

鑒于此,本研究在餐廚垃圾AD反應(yīng)器內(nèi)引入負(fù)荷擾動(dòng),誘導(dǎo)反應(yīng)器產(chǎn)生穩(wěn)定、失穩(wěn)、恢復(fù)和重新穩(wěn)定等不同運(yùn)行狀態(tài).采用454高通量測(cè)序分析不同運(yùn)行狀態(tài)下微生物的群落動(dòng)態(tài),并與理化參數(shù)和微生物活性相結(jié)合,擬探析AD過程穩(wěn)定性與微生物群落動(dòng)態(tài)的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)裝置為全自動(dòng)的機(jī)械攪拌釜式反應(yīng)器(BMR-A50U型,上海傲中),工作容積30L.頂部進(jìn)料,側(cè)邊有上、中、下3個(gè)排料口,底部設(shè)有排渣口.恒溫調(diào)節(jié)器控制水浴加熱,保持溫度恒定在(36±1)℃.反應(yīng)器頂部有攪拌電機(jī),轉(zhuǎn)速 60rpm,每間隔2h攪拌1h.反應(yīng)器配備了pH、ORP和溫度探頭,可實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)相應(yīng)參數(shù).產(chǎn)生的氣體經(jīng)干燥后,由紅外檢測(cè)器實(shí)時(shí)在線檢測(cè)氣體成分、流量及產(chǎn)氣總量.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和運(yùn)行方案

餐廚垃圾取自學(xué)校食堂,去除粗顆粒雜質(zhì)如骨頭、塑料等后,用粉碎機(jī)粉碎至5mm以下.隨后分裝到4L的儲(chǔ)存袋中,于-18℃冰凍保存.臨用前一周置于 4℃冰箱中解凍.接種污泥取自常溫下運(yùn)行的農(nóng)村戶用沼氣池.餐廚垃圾和接種污泥的理化性質(zhì)見表1.

表1 底物和接種污泥的理化特征Table 1 Physical and chemical characterization of substrate and seed sludge

運(yùn)行初期一次性向反應(yīng)器內(nèi)投加上述種泥30L,并預(yù)孵化兩周.隨后反應(yīng)器進(jìn)行半連續(xù)式啟動(dòng),初始負(fù)荷為 3gVS/(L·d).運(yùn)行過程中,反應(yīng)器每天出料 200mL用于理化參數(shù)測(cè)定;每周集中排渣一次,以保證反應(yīng)器有效容積.約一個(gè)月后,反應(yīng)器pH值、甲烷產(chǎn)率和VS去除率達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)(連續(xù)10d波動(dòng)不大于10%),表明系統(tǒng)已成功啟動(dòng).

反應(yīng)器成功啟動(dòng)后,分為4個(gè)階段運(yùn)行：第I階段(0～45d),反應(yīng)器依然在 3gVS/(L·d)的負(fù)荷下穩(wěn)定運(yùn)行,稱為穩(wěn)定運(yùn)行期;第II階段(46～90d),向反應(yīng)器內(nèi)引入負(fù)荷擾動(dòng),以 1gVS/(L·d)為梯度,每隔15d提高一個(gè)負(fù)荷檔次,直至反應(yīng)器運(yùn)行失敗,稱為負(fù)荷擾動(dòng)期;第 III階段(91～120d),停止進(jìn)料以消耗積累的中間代謝產(chǎn)物,稱為恢復(fù)期;第 IV階段(121～150d)再次進(jìn)料,但為避免突然進(jìn)料對(duì)長(zhǎng)期饑餓的系統(tǒng)造成過大的沖擊,首先分別在 1和2gVS/(L·d)的負(fù)荷下運(yùn)行7d,觀察到反應(yīng)器性能沒出現(xiàn)明顯惡化后,提高負(fù)荷至 3gVS/(L·d)運(yùn)

行至穩(wěn)定,此階段稱為重新穩(wěn)定期.

1.3 比產(chǎn)甲烷活性試驗(yàn)

取每個(gè)運(yùn)行階段末期(45, 90, 120和150d)的污泥進(jìn)行產(chǎn)甲烷活性實(shí)驗(yàn),分別以混合揮發(fā)性脂肪酸(50%乙酸, 25%丙酸和 25%丁酸)和乙酸為底物,來表征比產(chǎn)甲烷活性(SMA)和比乙酸產(chǎn)甲烷活性(SAMA)[16].實(shí)驗(yàn)在總?cè)莘e 500mL,有效容積400mL的反應(yīng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行.種泥和底物的終濃度分別為 5gVSS/L和2.5g/L(乙酸) 或 1g/L (混合酸).基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液占有效容積的20%.反應(yīng)物添加完成后,向反應(yīng)器內(nèi)補(bǔ)充蒸餾水以達(dá)到有效容積,隨即擰緊橡膠塞,并向反應(yīng)瓶?jī)?nèi)充 5min氮?dú)?以排空瓶?jī)?nèi)的氧氣,保證厭氧環(huán)境.密封后的玻璃瓶放入恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵溫度保持在(36±1)oC.產(chǎn)生的甲烷通過排 NaOH溶液(3mol/L)法進(jìn)行收集.計(jì)算微生物活性時(shí),以累積甲烷產(chǎn)量對(duì)時(shí)間作圖,產(chǎn)氣曲線上直線段部分的斜率與污泥濃度的比即為SMA或 SAMA,以 mgCODCH4/(gVSS·d)表示.此外,各階段SMA和SAMA的顯著性差異采用SPSS軟件,基于鄧肯多重范圍檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析,顯著性水平0.05.

1.4 物化參數(shù)分析

pH值、產(chǎn)氣量和氣體成分進(jìn)行在線檢測(cè). TS和VS采用烘干法測(cè)定.總揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和總堿度(TA)采用滴定法進(jìn)行測(cè)定.總氨氮(TAN)采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定.乙酸、丙酸等單個(gè)脂肪酸采用氣相色譜測(cè)定(Agilent 7890A,美國(guó)). C/N采用元素分析儀測(cè)定(Elementar VarioELⅢ元素分析儀,德國(guó)).蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測(cè)定,脂肪采用索氏提取法測(cè)定.VS去除率和游離氨(FAN)的計(jì)算見前期研究[17].

1.5 微生物分析

在每個(gè)運(yùn)行階段末期,從反應(yīng)器中采集3個(gè)污泥樣品,每個(gè)樣0.3g;使用E.Z.N.A Soil DNA試劑盒,參照操作說明書進(jìn)行基因組 DNA抽提.對(duì)所提取的DNA進(jìn)行純化,隨后三份DNA混合后對(duì)其16S rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增.細(xì)菌擴(kuò)增引物為27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和 533R(5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’);古菌擴(kuò)增引物為 344F(5’-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3’)和915R (5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’).擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)純化和定量,再送往上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行454高通量測(cè)序.所得原始核苷酸序列經(jīng)分類、修剪和標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后劃分到操作分類單元(OTU)水平.基于 OTU的多樣性分析采用 Mothur軟件(Mothur v.1.30.1)進(jìn)行.分類學(xué)水平的分析采用SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)軟件(http：//www.arb-silva.de).最終的核苷酸序列提交到 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為SRP065754.

2 結(jié)果和討論

2.1 系統(tǒng)效率和過程穩(wěn)定性對(duì)擾動(dòng)的響應(yīng)

從圖1可知,I階段TAN和FAN都呈增加趨勢(shì).據(jù)報(bào)道TAN和FAN濃度分別大于3000和100mg/L時(shí)會(huì)引起系統(tǒng)抑制[18],而該階段的TAN和FAN濃度分別小于1767mg/L和82mg/L,因此這兩個(gè)因子的抑制效果可以忽略.低負(fù)荷和無抑制使該階段具有良好的系統(tǒng)性能,其甲烷產(chǎn)率和VS去除率分別在(0.50±0.01)L CH4/gVS和(89.58±0.08)%,與前人的研究相近[19].狀態(tài)參數(shù)如VFA恒定在(2083±120)mg/L,小于其抑制閾值3000mg/L,pH也在最佳范圍以內(nèi),VFA/TA在0.2～0.35之間,VFAs以乙酸為主,丙酸保持在很低的水平,指示系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定.

II階段引入負(fù)荷擾動(dòng)以誘導(dǎo)系統(tǒng)失穩(wěn).從圖1中可知,負(fù)荷從 3gVS/(L·d)提高到 5gVS/(L·d)時(shí),VFA出現(xiàn)輕微上升,并伴隨著TA的輕微下降,這可能是FAN抑制引起的,因?yàn)镕AN在67d超過了 100mg/L.然而狀態(tài)參數(shù)并沒有持續(xù)背離其原有水平,而是穩(wěn)定在了新的濃度值,且系統(tǒng)效率并沒有受到影響.進(jìn)一步提高負(fù)荷至 6gVS/ (L·d),TAN和FAN繼續(xù)增加,同時(shí)VFA也迅速?gòu)?100mg/L (82d)積累到9443mg/L(90d).此時(shí),乙酸依然是最主導(dǎo)的VFA,但丙酸濃度上升了20倍,且丁酸和戊酸也出現(xiàn)了一定程度的積累(數(shù)據(jù)未顯示).積累的 VFAs消耗系統(tǒng)堿度,導(dǎo)致 pH下降,VFA/TA也上升至 0.79±0.22,指示系統(tǒng)失穩(wěn).此外甲烷含量、甲烷產(chǎn)率和VS去除率也出現(xiàn)不

同程度的降低.可見II階段末期所有指標(biāo)都背離了其正常范圍,共同指示出AD過程惡化.高負(fù)荷下,酸的產(chǎn)生和消耗不匹配可能是過程失穩(wěn)的主要原因;而氨氮的積累也許進(jìn)一步加劇了AD過程失穩(wěn).

圖1 厭氧消化反應(yīng)器運(yùn)行性能Fig.1 Process performance of the anaerobic digester

超負(fù)荷后,降低運(yùn)行負(fù)荷是進(jìn)行過程恢復(fù)的最普遍的方式[7].結(jié)合本研究的嚴(yán)重酸化現(xiàn)象,在III階段,系統(tǒng)沒有投加任何負(fù)荷.從圖中可知,隨著“饑餓”時(shí)間的延長(zhǎng),積累的VFAs逐漸被消耗,甲烷含量慢慢回升.值得注意的是,甲烷含量不只是恢復(fù)到穩(wěn)定期的水平,而是持續(xù)升高至明顯高于穩(wěn)定期.這可能是因?yàn)?隨著 VFA被消耗,之前與VFA結(jié)合的HCO3-被釋放,系統(tǒng)中TA增高,而TA的升高反過來又導(dǎo)致微生物代謝產(chǎn)生的CO2更多地溶解在液相中,而溢出到氣相的CO2減少,進(jìn)而導(dǎo)致氣相中甲烷含量增加.恢復(fù)期更高的堿度和pH印證了該推論.

隨著VFA降低到I階段的水平,反應(yīng)器重新進(jìn)料并逐步恢復(fù)I階段的運(yùn)行條件.從圖1可知, IV階段運(yùn)行穩(wěn)定后,與I階段具有類似的運(yùn)行效率.高的 TAN[(2810±53)mg/L]和 FAN[(134±18) mg/L]并沒有對(duì)該階段造成抑制,這可能是因?yàn)榘钡饾u積累的過程中,微生物被馴化了. Yenigün等[20]曾報(bào)道,馴化后微生物對(duì) FAN 和TAN 的耐受濃度分別可達(dá) 337～800mg/L和2800～6000mg/L.但I(xiàn)V階段的VFA和TA等較I階段稍高,這可能與微生物群落的轉(zhuǎn)移相關(guān).

2.2 比產(chǎn)甲烷活性對(duì)擾動(dòng)的響應(yīng)

圖2 不同運(yùn)行狀態(tài)下的SAMA和SMA變化Fig.2 Variations of SAMA and SMA during different operational stages

從圖 2可知,各階段的 SAMA在(0.109± 0.004)～(0.274±0.017)gCOD/(gVSS·d),與前人的研究結(jié)果相近[16,21].此外,每個(gè)階段的 SAMA都高于SMA.這可能是因?yàn)闇y(cè)定SMA采用的底物中,丙酸和丁酸不能直接被產(chǎn)甲烷菌利用,而要先被互養(yǎng)的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌轉(zhuǎn)化為乙酸和H2,再分別被乙酸型和氫型產(chǎn)甲烷菌降解.因此互養(yǎng)菌的活性直接影響了SMA的測(cè)定結(jié)果,更低的SMA也許預(yù)示著互養(yǎng)菌/氫型產(chǎn)甲烷菌活性不足[21].具體比較每一個(gè)運(yùn)行階段可知,I階段具有最高的產(chǎn)甲烷活性,這與該階段穩(wěn)定的運(yùn)行性能是對(duì)應(yīng)的.II階段SAMA和SMA分別下降了60.12%和72.51%,這可能是酸和氨積累導(dǎo)致的.而SMA更高程度的下降表明互養(yǎng)菌/氫型產(chǎn)甲烷活性在失穩(wěn)過程中比乙酸型產(chǎn)甲烷活性受損更重.恢復(fù)階

段兩類活性都有所回升,其中SMA平均增加3.03倍,而SAMA上升了1.64倍,這也許意味著互養(yǎng)/氫型產(chǎn)甲烷途徑在系統(tǒng)中的作用增強(qiáng)了.IV階段的SAMA與III階段沒有顯著差異,但SMA則顯著上升,進(jìn)一步表明互養(yǎng)/氫型產(chǎn)甲烷途徑的重要作用.此外,對(duì)比IV階段和I階段可知,盡管兩個(gè)階段都處于穩(wěn)定狀態(tài),但I(xiàn)V階段僅有SMA恢復(fù)到了I階段水平,SAMA則顯著低于I階段,這也許是該階段VFA更高的原因之一.

表2 不同運(yùn)行階段樣品中微生物序列的統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistics analysis of microbial sequences in samples retrieved from different operational stages

2.3 測(cè)序結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

從表2可知,細(xì)菌和古菌樣品的文庫(kù)覆蓋率都在 99%以上,表明系統(tǒng)中大部分的微生物已被檢測(cè)到.此外,細(xì)菌豐富度和多樣性都高于古菌,這與早期研究一致[22].進(jìn)一步對(duì)比每個(gè)運(yùn)行狀態(tài)下的微生物生態(tài)學(xué)參數(shù)可知,細(xì)菌和古菌的各類參數(shù)均與過程穩(wěn)定性沒有明顯相關(guān)性.可見,多樣性指數(shù)并不能很好地指示反應(yīng)器運(yùn)行狀態(tài).Goux等[4]也有類似結(jié)論,他們指出微生物多樣性與反應(yīng)器過程穩(wěn)定性之間沒有明確相關(guān)性,群落結(jié)構(gòu)才是決定微生物功能的重要因素.因此從群落結(jié)構(gòu)演替的角度進(jìn)一步分析失穩(wěn)機(jī)理是必要的.

2.4 產(chǎn)甲烷菌群落動(dòng)態(tài)

從圖 3可知,乙酸營(yíng)養(yǎng)型的甲烷鬃菌(Methanothrix)、 氫 營(yíng) 養(yǎng) 型 的 甲 烷 囊 菌(Methanoculleus)和甲烷螺菌(Methanospirillum)是系統(tǒng)內(nèi)主要的甲烷菌屬.此外混合營(yíng)養(yǎng)型的甲烷八疊球菌(Methanosarcina)也檢測(cè)到了,但其豐度一直很低.具體而言,I階段甲烷鬃菌是系統(tǒng)內(nèi)最主導(dǎo)的甲烷菌,相對(duì)豐度為 46.97%;氫型產(chǎn)甲烷菌中甲烷螺菌主導(dǎo),具有 35.35%的豐度,甲烷囊菌次之,占 9.89%.可見,該階段具備“甲烷鬃菌主導(dǎo),乙酸營(yíng)養(yǎng)型和氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌共存”的均衡古菌群落特征[6,23],這可能是該階段性能穩(wěn)定的原因之一.

II階段酸和氨的積累大幅度地削弱了SAMA,但甲烷鬃菌的相對(duì)豐度卻增加至58.47%.其他研究者同樣報(bào)道過甲烷菌豐度與活性不成比例的現(xiàn)象[24-25].前期研究中,作者也詳細(xì)闡述了這種異常的可能原因[1].相應(yīng)的,該階段總氫型產(chǎn)甲烷菌的豐度從 45.27%下降至 37.68%,這會(huì)降低 H2消耗效率.此外,主導(dǎo)的氫型產(chǎn)甲烷菌由甲烷螺菌向甲烷囊菌轉(zhuǎn)移.據(jù)報(bào)道[25],甲烷囊菌比甲烷螺菌具有更高的H2親和力,因此這種演替會(huì)進(jìn)一步降低H2消耗速率.這與該階段SMA的大幅下降是一致的.

圖3 甲烷菌群落在屬水平的動(dòng)態(tài)演替Fig.3 Dynamics of methanogens at the genus level

III階段甲烷鬃菌豐度基本不變,甲烷螺菌豐度下降,而甲烷囊菌豐度繼續(xù)升高,且在 IV階段成為系統(tǒng)中最主導(dǎo)的甲烷菌.甲烷囊菌取代甲烷螺菌成為主導(dǎo)氫型產(chǎn)甲烷菌可能與甲烷囊菌具有更高的氨氮耐受限值有關(guān)[26].此外甲烷囊菌在特定的途徑上有更多的基因含量,有些會(huì)直接參與生物產(chǎn)甲烷過程,如它們可以采用乙醇和大量的二級(jí)醇作為電子供體來產(chǎn)甲烷[26],這些特征使得它們?cè)诓煌纳L(zhǎng)環(huán)境中存活更具優(yōu)勢(shì).因此,

綜合來看,超負(fù)荷過程中,酸和氨積累導(dǎo)致主導(dǎo)產(chǎn)甲烷菌呈現(xiàn)出了乙酸營(yíng)養(yǎng)型的甲烷鬃菌向氫營(yíng)養(yǎng)型的甲烷囊菌轉(zhuǎn)移的趨勢(shì);而主導(dǎo)氫型產(chǎn)甲烷菌呈現(xiàn)出甲烷螺菌向甲烷囊菌轉(zhuǎn)移的趨勢(shì).其他研究者在有擾動(dòng)和無擾動(dòng)的厭氧消化反應(yīng)器中都曾觀察到類似現(xiàn)象[8,11,13,27].

2.5 細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)

圖4 細(xì)菌群落在門水平的動(dòng)態(tài)演替Fig.4 Dynamics of bacterial communities at the phylum level

由圖4和表3可知,擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、螺旋菌門(Spirochaetae)、互養(yǎng)菌門(Synergistete)、熱袍菌門(Thermotogae)、柔膜菌門(Tenericutes)和放線菌門(Actinobacteria)是反應(yīng)器內(nèi)的主導(dǎo)細(xì)菌門(至少在一個(gè)樣品中相對(duì)豐度大于1%).這與Guo等[5]及 Jang等[13]在餐廚垃圾厭氧消化系統(tǒng)中檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)微生物是類似的.其中,擬桿菌門和厚壁菌門是眾所周知的持久性微生物,能在AD過程中產(chǎn)生各種代謝酶,主要參與水解和酸化階段.如擬桿菌門的Bacteroides屬發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生乙酸[28];而Petrimonas屬發(fā)酵糖類,主要代謝產(chǎn)物為乙酸和丙酸; vadinBC27 和Proteiniphilum屬則是蛋白質(zhì)或氨基酸降解菌[5].厚壁菌門的梭菌綱(Clostridia)除水解酸化外,還涉及產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸和乙酸氧化.如其代表屬Syntrophomonas可與氫型產(chǎn)甲烷菌互營(yíng)將各種有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為 H2和乙酸[28];另一代表屬Syntrophaceticus則為乙酸氧化菌,可將乙酸分解為 H2和 CO2[29].互養(yǎng)菌門也涉及酸化和乙酸氧化[6,13],Carballa等[6]和 Jang等[13]指出它們的存在代表了系統(tǒng)良好的耗乙酸性能.螺旋菌門的代表屬 Spirochaeta具有葡萄糖利用活性[5];Treponema則包含同型產(chǎn)乙酸微生物,可轉(zhuǎn)化H2和CO2為乙酸[30].熱袍菌門以060F05-B-SD-P93為代表屬,能產(chǎn)生胞外聚合物,形成聚集體以增大氫傳遞效率.厭氧反應(yīng)器中柔膜菌門微生物似乎主要參與酸化階段,可為乙酸型產(chǎn)甲烷菌提供乙酸[31].放線菌門據(jù)報(bào)道也參與酸化過程,能降解餐廚垃圾為 VFA,且放線菌門的有些微生物會(huì)產(chǎn)生丙酸[13].

表3 細(xì)菌在綱和屬水平上的分布表(僅列出了至少在一個(gè)樣品內(nèi)相對(duì)豐度大于1.0%的屬)Table 3 Taxonomic compositions of bacterial communities at the class and genus levels

對(duì)比各階段細(xì)菌的演替動(dòng)態(tài)可知,失穩(wěn)過程中產(chǎn)酸的柔膜菌門和放線菌門豐度急劇增加.

Guo等[5]曾在超負(fù)荷的餐廚垃圾厭氧消化系統(tǒng)中觀察到柔膜菌門增加的現(xiàn)象,而 Regueiro等[7]及Jang等[13]觀察到超負(fù)荷時(shí)放線菌門的相對(duì)豐度增大.產(chǎn)酸菌的豐度增加也許是造成該階段高VFA產(chǎn)量的主要原因.高的VFA產(chǎn)率誘導(dǎo)了系統(tǒng)內(nèi)互養(yǎng)脂肪酸降解菌的增殖.從表3可知,該階段梭菌綱豐度急劇增加.然而,梭菌綱也是著名的氫生產(chǎn)者,它們的增加代表它們向系統(tǒng)內(nèi)釋放了更多的 H2[22].與此矛盾的是,互營(yíng)的氫型產(chǎn)甲烷菌豐度和活性在該階段顯著下降.這種壓力下,同型產(chǎn)乙酸的 Treponema屬作為耗氫微生物出現(xiàn).據(jù)報(bào)道,同型產(chǎn)乙酸菌一般在低溫下被觀察到,在中或高溫下,由于它們產(chǎn)能低于氫型產(chǎn)甲烷菌,通常不具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[32].然而,Wang等[30]觀察到在有H2流入的中溫污泥AD反應(yīng)器內(nèi),Treponema和氫型產(chǎn)甲烷菌共存. Siriwongrungson等[32]在丁酸高溫AD反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn),同型產(chǎn)乙酸能在產(chǎn)甲烷途徑被抑制的情況下,充當(dāng)替代耗氫途徑.可見,在H2產(chǎn)量急劇增加而耗氫效率急劇下降的II階段,Treponema作為耗氫的替代微生物出現(xiàn)是可以理解的,這甚至可能是AD自我優(yōu)化的表現(xiàn)形式.然而,這種自我優(yōu)化并沒能阻止其失穩(wěn),這是因?yàn)楸M管Treponema將多余的H2轉(zhuǎn)化為了乙酸,乙酸型產(chǎn)甲烷菌的活性卻也受到了影響,它們同樣無法消耗過多的乙酸,最終導(dǎo)致了VFA積累.

恢復(fù)和重新穩(wěn)定過程中,梭菌綱豐度進(jìn)一步增加,反應(yīng)器中積累的 VFA卻逐漸被消耗.這一方面是因?yàn)榉啪€菌門和柔膜菌門等產(chǎn)酸菌豐度下降,VFA產(chǎn)量下降了;另一方面是由于系統(tǒng)的SMA增加,使氫的產(chǎn)生和消耗之間達(dá)到了平衡.與此同時(shí),細(xì)菌也向著產(chǎn)氫菌的方向轉(zhuǎn)移.如發(fā)酵碳水化合物的Bacteroides和Petrimonas屬的豐度在擾動(dòng)后被Gelria和060F05-B-SD-P93屬部分取代,而后兩者均能降解碳水化合物產(chǎn)氫. Treponema屬的豐度在后兩個(gè)運(yùn)行階段逐漸下降,而與之具有相反功能的Syntrophaceticus屬豐度增加,氧化乙酸為氫.微生物的這些演替也許都暗示著擾動(dòng)后反應(yīng)器內(nèi)出現(xiàn)了產(chǎn)甲烷途徑的轉(zhuǎn)移,這與其活性的變化規(guī)律是一致的.另外,盡管 I和IV階段的性能類似,對(duì)比兩階段的微生物群落可知,細(xì)菌和古菌群落都發(fā)生了明顯的變化,擾動(dòng)后群落達(dá)到了新的平衡.類似現(xiàn)象在Luo等[33]及Goux等[4]的研究中也曾被報(bào)道過.這也許預(yù)示著微生物存在高度的功能冗余.

3 結(jié)論

3.1 穩(wěn)定運(yùn)行階段反應(yīng)器中甲烷鬃菌主導(dǎo),乙酸營(yíng)養(yǎng)型和氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌共存,水解、酸化和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌等微生物均衡生長(zhǎng),反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定,甲烷產(chǎn)率和 VS去除率分別在(0.50±0.01) LCH4/gVS和(89.58±0.08)%,各項(xiàng)狀態(tài)參數(shù)均在閾值以下,無中間代謝產(chǎn)物積累.

3.2 高負(fù)荷下產(chǎn)酸的柔膜菌門和放線菌門微生物急劇繁殖造成高VFA產(chǎn)率,是系統(tǒng)失穩(wěn)的第一個(gè)原因.高VFA產(chǎn)率誘導(dǎo)互養(yǎng)脂肪酸降解菌大量生長(zhǎng),導(dǎo)致系統(tǒng) H2產(chǎn)量增加;但互營(yíng)的氫型產(chǎn)甲烷菌豐度和活性均下降,造成 H2消耗速率下降,產(chǎn)氫細(xì)菌和耗氫甲烷菌的代謝失衡是系統(tǒng)失穩(wěn)的第二個(gè)原因.此外,VFA和氨積累使SAMA下降60.12%;且引起主導(dǎo)氫型甲烷菌從甲烷螺菌轉(zhuǎn)為甲烷囊菌,導(dǎo)致SMA下降72.51%,甲烷菌的低代謝活性是系統(tǒng)失穩(wěn)的又一個(gè)原因.

3.3 重新穩(wěn)定階段反應(yīng)器雖然恢復(fù)了原有運(yùn)行條件和性能,但微生物達(dá)到了新的平衡.細(xì)菌向產(chǎn)氫菌方向轉(zhuǎn)移;產(chǎn)甲烷途徑呈現(xiàn)出乙酸營(yíng)養(yǎng)型向氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷轉(zhuǎn)移的趨勢(shì),氫型產(chǎn)甲烷菌豐度和活性均上升.這表明微生物應(yīng)對(duì)擾動(dòng)時(shí)呈現(xiàn)出高度的功能冗余.

[1] Li L, He Q, Ma Y, et al. Dynamics of microbial community in a mesophilic anaerobic digester treating food waste： Relationship between community structure and process stability [J]. Biores. Technol., 2015,189：113-120.

[2] 尹福斌,李子富,王冬泠,等.加堿預(yù)處理對(duì)致病微生物去除效果及動(dòng)力學(xué)研究 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2015,35(1)：196-203.

[3] 彭緒亞,洪俊華,賈傳興,等.磷酸酯酶活性對(duì)餐廚垃圾單相厭氧消化抑制的預(yù)警作用 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2012,32(3)：541-546.

[4] Goux X, Calusinska M, Lemaigre S, et al. Microbial community dynamics in replicate anaerobic digesters exposed sequentially to increasing organic loading rate, acidosis, and process recovery [J]. Biotechnol. Biofuels, 2015,8(1)：1-18.

[5] Guo X, Wang C, Sun F, et al. A comparison of microbial

characteristics between the thermophilic and mesophilic anaerobic digesters exposed to elevated food waste loadings [J]. Biores. Technol., 2014,152：420-428.

[6] Carballa M, Regueiro L, Lema J M. Microbial management of anaerobic digestion： exploiting the microbiome-functionality nexus [J]. Curr. Opin. Biotech., 2015,33：103-111.

[7] Regueiro L, Lema J M, Carballa M. Key microbial communities steering the functioning of anaerobic digesters during hydraulic and organic overloading shocks [J]. Biores. Technol., 2015, 197：208-216.

[8] 劉 陽(yáng),彭永臻,韓玉偉,等.游離氨對(duì)熱水解聯(lián)合中溫厭氧消化處理剩余污泥的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2015,35(9)：2650-2657.

[9] 何 強(qiáng),孫興福,艾海男,等.兩相一體式污泥濃縮消化反應(yīng)器運(yùn)行效能及其微生物特性 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2012,32(11)：2039-2046.

[10] Karakashev D, Batstone D J, Angelidaki I. Influence of environmental conditions on methanogenic compositions in anaerobic biogas reactors [J]. Appl. Environ. Microb., 2005,71(1)：331-338.

[11] Williams J, Williams H, Dinsdale R, et al. Monitoring methanogenic population dynamics in a full-scale anaerobic digester to facilitate operational management [J]. Biores. Technol., 2013,140：234-242.

[12] Cho S, Im W, Kim D, et al. Dry anaerobic digestion of food waste under mesophilic conditions： Performance and methanogenic community analysis [J]. Biores. Technol., 2013,131：210- 217.

[13] Jang H M, Kim J H, Ha J H, et al. Bacterial and methanogenic archaeal communities during the single-stage anaerobic digestion of highstrength food wastewater [J]. Biores. Technol., 2014,165：174-182.

[14] Polag D, May T, Müller L, et al. Online monitoring of stable carbon isotopes of methane in anaerobic digestion as a new tool for early warning of process instability [J]. Biores. Technol., 2015,197：161-170.

[15] Razaviarani V, Buchanan I D. Reactor performance and microbial community dynamics during anaerobic co-digestion of municipal wastewater sludge with restaurant grease waste at steady state and overloading stages [J]. Biores. Technol., 2014,172：232-240.

[16] Regueiro L, Veiga P, Figueroa M, et al. Relationship between microbial activity and microbial community structure in six full-scale anaerobic digesters [J]. Microbiol. Res., 2012,167(10)：581-589.

[17] 唐 波,李 蕾,何 琴,等.總氨氮在餐廚垃圾厭氧消化系統(tǒng)中的積累及其抑制作用 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2016,(1)：210-216.

[18] Heo N H, Park S C, Kang H. Effects of mixture ratio and hydraulic retention time on single-stage anaerobic co-digestion of food waste and waste activated sludge [J]. J. Environ. Sci. Heal. A., 2004,39(7)：1739-1756.

[19] Nagao N, Tajima N, Kawai M, et al. Maximum organic loading rate for the single-stage wet anaerobic digestion of food waste [J]. Biores. Technol., 2012,118：210-218.

[20] Yenigün O, Demirel B. Ammonia inhibition in anaerobic digestion： A review [J]. Process Biochem., 2013,48(5/6)：901-911.

[21] Palatsi J, Illa J, Prenafeta-Boldú F X, et al. Long-chain fatty acids inhibition and adaptation process in anaerobic thermophilic digestion： Batch tests, microbial community structure and mathematical modelling [J]. Biores. Technol., 2010,101(7)：2243-2251.

[22] Kim S, Bae J, Choi O, et al. A pilot scale two-stage anaerobic digester treating food waste leachate (FWL)： Performance and microbial structure analysis using pyrosequencing [J]. Process Biochem., 2014,49(2)：301-308.

[23] Lerm S, Kleyb?cker A, Miethling-Graff R, et al. Archaeal community composition affects the function of anaerobic co-digesters in response to organic overload [J]. Waste Manage., 2012,32(3)：389-399.

[24] Schauer-Gimenez A E, Zitomer D H, Maki J S, et al. Bioaugmentation for improved recovery of anaerobic digesters after toxicant exposure [J]. Water Res., 2010,44(12)：3555-3564.

[25] Shigematsu T, Era S, Mizuno Y, et al. Microbial community of a mesophilic propionate-degrading methanogenic consortium in chemostat cultivation analyzed based on 16S rRNA and acetate kinase genes [J]. Appl. Microbiol. Biot., 2006,72(2)：401-415.

[26] Franke-Whittle I H, Walter A, Ebner C, et al. Investigation into the effect of high concentrations of volatile fatty acids in anaerobic digestion on methanogenic communities [J]. Waste Manage., 2014,34(11)：2080-2089.

[27] Lerm S, Kleyb?cker A, Miethling-Graff R, et al. Archaeal community composition affects the function of anaerobic co-digesters in response to organic overload [J]. Waste Manage., 2012,32(3)：389-399.

[28] Li A, Chu Y N, Wang X, et al. A pyrosequencing-based metagenomic study of methane-producing microbial community in solid-state biogas reactor [J]. Biotechnol. Biofuels, 2013,6(1)：3.

[29] Ziganshin A M, Liebetrau J, Pr?ter J, et al. Microbial community structure and dynamics during anaerobic digestion of various agricultural waste materials [J]. Appl. Microbiol. Biot., 2013, 97(11)：5161-5174.

[30] Wang W, Xie L, Luo G, et al. Performance and microbial community analysis of the anaerobic reactor with coke oven gas biomethanation and in situ biogas upgrading [J]. Biores. Technol., 2013,146：234-239.

[31] Wirth R, Kovács E, Maróti G, et al. Characterization of a biogasproducing microbial community by short-read next generation DNA sequencing [J]. Biotechnol. Biofuels, 2012,5(1)： 41.

[32] Siriwongrungson V, Zeng R J, Angelidaki I. Homoacetogenesis as the alternative pathway for H2sink during thermophilic anaerobic degradation of butyrate under suppressed methanogenesis [J]. Water Res., 2007,41(18)：4204-4210.

[33] Luo G, De Francisci D, Kougias P G, et al. New steady-state microbial community compositions and process performances in biogas reactors induced by temperature disturbances [J]. Biotechnol. Biofuels, 2015,8(1)：1-10.

Investigation on the relationship between process stability and microbial community in anaerobic digestion.

LI Lei, HE Qin, MA Yao, ZHAO Xiao-fei, QU Li, WANG Xiao-ming, PENG Xu-ya*(Key Laboratory of Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environment, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China). China Environmental Science, 2016,36(11)：3397～3404

To explore the relationship between process stability and microbial community in anaerobic digestion, organic loading rate (OLR) disturbances were introduced into an anaerobic digester treating food waste (FW) to induce different process stages. Physico-chemical analysis along with the 454-pyrosequencing microbial technique were performed to monitor the responses of state parameters as well as the dynamics of microbial community. Results showed that balanced community structure ensured the stable operation of the digester. Under steady-state conditions, the methane yield reached (0.50±0.01) LCH4/gVS and volatile solids (VS) removal rate reached (89.58±0.08) %. Under high OLR conditions, the relative abundance of acid-producing bacteria (phyla Tenericutes and Actinobacteria) increased dramatically, which induced the proliferation of syntrophic fatty acid degrading bacteria (class Clostridia), while the abundance and activity of syntrophic hydrogenotrophic methanogens decreased. The imbalance relationship between methanogens and syntrophic fatty acid degrading bacteria caused their inefficient syntrophy, eventually resulting in volatile fatty acid (VFA) accumulation and process deterioration. Moreover, the accumulated VFA and ammonia reduced the specific acetoclastic methanogenic activity (SAMA) and specific methanogenic activity (SMA) by 60.12% and 72.51%, respectively, which further deteriorated the digestion process. Although the digester afterwards recovered to its original operational conditions and process performance, the microbial community profile changed and achieved new steady-state conditions.

food waste；anaerobic digestion；process stability；microbial community；454-pyrosequencing

X705

A

1000-6923(2016)11-3397-08

李 蕾(1989-),女,江西宜春人,重慶大學(xué)博士研究生,研究方向?yàn)楣腆w廢物污染控制與資源化.發(fā)表論文10余篇.

2016-04-22

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃(2010BAC67B01)

* 責(zé)任作者, 教授, xypeng33@126.com