鮑科染色體研究進展

郭戰(zhàn)勝，侯旭光

( 山東大學(xué)(威海)海洋學(xué)院，山東 威海 264209 )

鮑科染色體研究進展

郭戰(zhàn)勝，侯旭光

( 山東大學(xué)(威海)海洋學(xué)院，山東 威海 264209 )

鮑；染色體核型；染色體帶型；熒光原位雜交

鮑科動物簡稱鮑或鮑魚，隸屬于軟體動物門、原始腹足目，是重要的海生單殼經(jīng)濟貝類。鮑現(xiàn)存56種，除北冰洋外，世界大部分海域都有分布，目前能夠進行規(guī)模化捕撈和養(yǎng)殖的種類有20余種。

隨著鮑養(yǎng)殖業(yè)的興起和快速發(fā)展，對鮑的各項研究也逐漸開展，主要涉及遺傳育種、養(yǎng)殖技術(shù)、生態(tài)、分子和細胞學(xué)方面的研究[1-8]。細胞遺傳學(xué)是遺傳育種研究的基礎(chǔ)，其中染色體研究是細胞遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，主要包括染色體核型分析、帶型分析、功能基因定位等。這些研究不僅為鮑遺傳育種提供理論依據(jù)，同時對認識和探索鮑染色體分類系統(tǒng)和進化關(guān)系具有重要意義[9-10]。截至目前，鮑科中有17種開展過核型研究，2種進行過帶型研究。筆者通過對鮑科染色體的研究成果的總結(jié)，討論今后發(fā)展的途徑和方向。

1 染色體核型研究

1.1 染色體核型研究現(xiàn)狀

核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型，包括染色體數(shù)目、大小、形態(tài)特征的總和。目前有17種鮑染色體核型被研究和報道(表1)。染色體數(shù)目有2n=28、2n=32和2n=36 3種類型。其中具有28條染色體的有1種，32條染色體的有5種，36條染色體的有11種。根據(jù)核型公式，具有相同數(shù)目染色體的鮑核型差異不大，所有種類都有中部著絲粒染色體和亞中部著絲粒染色體兩種主要類型，雜色鮑(Haliotisdisversicolor)、羊鮑(H.ovina)、黑鮑(H.cracherodii)和綠鮑(H.fulgens)還含有端部著絲粒染色體。

由表1可知，同一種鮑試驗研究得到的核型公式結(jié)果顯示不一致，可能有4方面原因：(1)試驗過程中，如使用秋水仙素含量的大小、使用低滲液的種類和含量以及低滲處理時間的長短等均影響核型數(shù)目與形態(tài)的變化；(2)染色體著絲粒斷裂、融合或結(jié)構(gòu)重排等造成的同一物種不同個體染色體核型多態(tài)現(xiàn)象[13]；(3)不同地理種群長期分化造成核型多態(tài)現(xiàn)象；(4)試驗者操作、觀察造成誤差。

1.2 染色體核型與雜種鑒定

雜交是育種的重要手段，染色體核型分析可以用于鑒定雜種是否真正產(chǎn)生。Cai等[17]對雜色鮑雌鮑與盤鮑(H.discusdiscus)雄鮑雜交F1核型分析表明，雜交子代染色體數(shù)目是多變的，包括2n=32和34，同時還有很多非整倍體?？虏艧ǖ萚18]證實這兩種鮑不是真正意義的雜交，而是盤鮑精子刺激雜色鮑卵子引起的雌核發(fā)育。Amar-Basulto等[27]對紅鮑(H.rufescens)、皺紋盤鮑(H.discushannai)及其雜交子代進行核型分析，結(jié)果表明染色體數(shù)均為2n=36，核型分別為10m+7sm+1st、10m+8sm和10m+7sm+1sm/st，3種鮑染色體具有一定同源性，但是雜交鮑第16對染色體與其他兩種不同，可以進行種類鑒別。Botwright等[44]對澳大利亞黑唇鮑(H.rubra)、綠唇鮑(H.laevigata)及其雜交鮑核型進行分析，結(jié)果表明3種鮑染色體數(shù)目2n=36，核型為10m+7sm+1st，黑唇鮑與綠唇鮑核型具有高度同源性，使雜交受精率比較高。在雜交育種過程中，雜交子代與雙親染色體的數(shù)目、形態(tài)、臂長和臂比的區(qū)別都可以用于驗證雙親是否真正雜交。除此之外，分子標記、形態(tài)學(xué)標記等也可以鑒定雜交與否。

表1 鮑科染色體研究概況

注：2n，二倍體數(shù)目； m，中部著絲粒染色體；sm，亞中部著絲粒染色體；st，亞端部著絲粒染色體；t，端部著絲粒染色體； sm/st 代表染色體可歸為兩種類型；C，C帶；NORs，銀染帶；G，G帶.

1.3 從染色體數(shù)目看鮑科物種進化和親緣關(guān)系

鮑科現(xiàn)存56種，進行染色體研究的有17種，由表1可知，疣鮑2n=28，分布于地中海地區(qū)；雜色鮑、羊鮑、平鮑、多變鮑和耳鮑2n=32,分布于印度—太平洋地區(qū)；其余11種2n=36，分布于北太平洋地區(qū)和南非—澳大利亞地區(qū)。這一鮑科染色體數(shù)目分布是有規(guī)律的，支持目前學(xué)術(shù)界廣泛接受的進化模型—特斯拉海起源模型：原始鮑種起源于古代特拉斯海，經(jīng)過進化引發(fā)現(xiàn)代地中海鮑種和印度洋熱帶鮑種的產(chǎn)生。印度洋熱帶鮑種分別向東南方向和東北方向遷移; 其中，在東南方向遷移引發(fā)南非、澳大利亞、新西蘭和熱帶西太平洋鮑種產(chǎn)生；在東北方向遷移引發(fā)北太平洋鮑種產(chǎn)生，北太平洋鮑種又輻射出加利福尼亞和北太平洋鮑種[43]。

2 染色體帶型研究

染色體顯帶技術(shù)是指通過一定的染色步驟使染色體一定部位內(nèi)呈現(xiàn)出深淺不一條紋的細胞學(xué)方法，實質(zhì)是染色體經(jīng)過酸、堿、鹽或酶等生物或物理方法的處理，使染色體裂解或者DNA片段斷裂或者丟失，由DNA或者蛋白質(zhì)差別提取及染料在DNA側(cè)面的堆積而導(dǎo)致產(chǎn)生條紋[44]。它不僅能夠準確地將同源染色體進行配對和核型排列，而且能夠精細地辨認染色體的結(jié)構(gòu)和變化[13]。染色體顯帶技術(shù)在高等動物中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，但是在海洋貝類中尤其是鮑科中研究報道相對較少。

C帶是指染色體經(jīng)過酸、堿、鹽溶液的作用，常染色質(zhì)DNA被抽提掉，而顯示著絲粒及其他部位異染色質(zhì)。C帶具有物種和染色體特異性，可以鑒別染色體和研究染色體的結(jié)構(gòu)功能。目前僅有皺紋盤鮑和紅鮑開展過C帶研究(表1)，蔡明夷等[28]對皺紋盤鮑C帶開展研究，結(jié)果表明皺紋盤鮑C帶包括著絲粒、端部和臂間C帶3種類型，著絲粒C帶的分布比較穩(wěn)定,而端部和臂間C帶分布相對不穩(wěn)定,呈現(xiàn)出多態(tài)性。

NORs帶指染色體上具有活性或者潛在活性的核仁組織區(qū)酸性蛋白進行銀染而顯色的條帶，沒有活性的無法顯示染色。NORs的位置和數(shù)目隨著物種而改變，可以用來進行親緣關(guān)系和物種進化的相關(guān)研究。目前僅皺紋盤鮑開展過NORs研究(表1)。Okumura等[24]研究皺紋盤鮑NOR帶,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOR帶顯示在2 對染色體的長臂端部，然而不同細胞中NOR帶在染色體顯示的編號不同，這種NOR位置的不確定性可能與rRNA 基因的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。Wang等[29]對皺紋盤鮑福建養(yǎng)殖群體細胞遺傳學(xué)研究，結(jié)果表明NORs通常位于第14和17號染色體長臂末端，有時候在別的染色體短臂末端也有分布。NORs 帶的數(shù)目一般隨演化程度的提高由少變多,鮑NORs 數(shù)據(jù)對揭示其進化關(guān)系有一定幫助。

熒光帶型是指根據(jù)熒光染料在染色體不同結(jié)構(gòu)區(qū)域顯示的顏色深淺不同而產(chǎn)生的帶型,通常用于揭示染色體上的 AT/GC 富含區(qū), 該帶型可作為識別特定染色體的重要標志[45]。目前有6種鮑進行過熒光帶型研究，包括皺紋盤鮑、紅鮑及其雜交鮑、黑唇鮑、綠唇鮑及其雜交鮑(表1)。Amar-Basulto等[27]利用DAPI熒光確定皺紋盤鮑、紅鮑及其雜交鮑熒光帶型在染色體分布位置的不同，可以進行種類鑒別；Gallardo-Escarate等[37]利用DA/DAPI熒光染料確定紅鮑染色體DNA濃度；Natasha[44]對黑唇鮑、綠唇鮑及其雜交鮑染色體熒光帶型進行分析，鑒別種類。

3 熒光原位雜交技術(shù)在鮑科染色體研究中的應(yīng)用

熒光原位雜交技術(shù)是一種快速、準確、靈敏的細胞遺傳學(xué)分析技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于染色體重排與進化、早期性別鑒定、基因定位、染色體鑒別及雜交鑒定等方面。熒光原位雜交技術(shù)基本原理是根據(jù)DNA堿基互補配對原則，利用熒光標記的已知序列單鏈核苷酸作為探針，與待測樣本中染色體上互補的單核苷酸序列特異性結(jié)合，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測染色體DNA進行定性、定量或相對定位分析。該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于高等動物，但在海洋貝類尤其是鮑中的應(yīng)用仍較少。

3.1 端粒序列定位

端粒是指染色體末端所特有的帽子片段。高等動物的端粒序列包括數(shù)百次(TTAGGG) 的核苷酸重復(fù)，但是絕大部分海洋貝類的端粒序列還是未知的。目前，報道有4種鮑利用FISH技術(shù)進行端粒序列定位，包括皺紋盤鮑、紅鮑、綠鮑和黃鮑(表1)。Mizuho等[26]利用熒光原位雜交技術(shù)對皺紋盤鮑端粒序列進行研究，分別運用(TTAGGG)n和(TTAGG)n序列探針對皺紋盤鮑染色體進行熒光標記，結(jié)果表明，(TTAGGG)n探針在皺紋盤鮑所有染色體端粒區(qū)域都有信號，但是(TTAGG)n探針卻沒有明顯的信號，說明皺紋盤鮑端粒末端含有(TTAGGG)n序列。Gallardo-Escárate等[40]利用(TTAGGG)n和 (GATA)n微衛(wèi)星序列作為探針對綠鮑和黃鮑端粒序列進行分析，結(jié)果表明(TTAGGG)n序列在兩種鮑所有染色體端部均有信號，但是(GATA)n序列僅在一些染色體間區(qū)和末端有信號。同時，Gallardo-Escárate等[35]對紅鮑端粒序列進行分析，結(jié)果與綠鮑、黃鮑結(jié)果一致。上述結(jié)果說明重復(fù)序列(TTAGGG)n有可能是鮑的端粒序列。

3.2 rDNA基因定位

通過利用熒光原位雜交技術(shù)對核糖體rDNA定位，可以明晰染色體NORs的分布情況，熒光原位雜交技術(shù)彌補了銀染法檢測NORs的不足，對有或無轉(zhuǎn)錄活性的NORs位點都可以檢測到。目前，共有皺紋盤鮑、紅鮑、綠鮑和黃鮑4種鮑進行過rDNA定位研究(表1)。蔡明夷等[28]對皺紋盤鮑rDNA定位，結(jié)果表明， 皺紋盤鮑中期染色體上分布著4個大亞基 rDNA 位點。Wang等[29]對皺紋盤鮑18 S rDNA位點定位進行分析，結(jié)果表明18 S rDNA位點具有多態(tài)性，但是通常在14和17號染色體長臂末端端粒區(qū)域具有較強的信號。Gallardo-Escárate等[35，40]對紅鮑、綠鮑和黃鮑研究結(jié)果表明，3種鮑均有2個信號明確和若干個不穩(wěn)定的大亞基 rDNA 位點。核糖體內(nèi)rDNA基因進化速度很緩慢，rDNA的熒光原位雜交定位結(jié)果可被用于鮑的生物系統(tǒng)進化研究，驗證鮑科動物進化模型——特斯拉海起源模型的正確性。

4 與鮑科染色體研究相結(jié)合進行分子生物學(xué)研究進展

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合進行研究成為海洋生物研究的熱點。其中以染色體研究結(jié)果為參考，進行的分子生物學(xué)研究主要有大片段基因組文庫構(gòu)建、遺傳連鎖圖譜和物理圖譜的繪制與整合、功能基因在染色體上的定位等等。在海洋生物，尤其是在鮑科動物中，與染色體研究相結(jié)合進行的分子生物學(xué)研究十分緩慢，僅限于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位、著絲粒作圖與遺傳圖譜整合。

遺傳連鎖圖譜是指某一物種的染色體圖譜，顯示所知的基因和/或遺傳標記的相對位置，而不是在每條染色體上特殊的物理位置,而QTL是指在染色體上具有表達效應(yīng)的節(jié)段。遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及QTL定位為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的規(guī)模化育種提供重要的遺傳理論基礎(chǔ)[46]。目前，在鮑科中共4種鮑構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜和QTL定位，包括非洲鮑[47]、黑唇鮑[48]、雜色鮑[49-51]和皺紋盤鮑[52-53], 其中Nie等[54]構(gòu)建了皺紋盤鮑較高密度微衛(wèi)星—著絲粒圖譜，并與遺傳圖譜進行整合，定位了連鎖群中著絲粒的位置。

5 問題與展望

目前，鮑染色體研究未有大的突破性進展，試驗材料是主要限制因素。在制備染色體時，由于擔(dān)輪幼蟲期細胞分裂比較旺盛且容易觀察而成為試驗首選，但是受到繁殖期的制約。利用鰓或外套膜等組織則無季節(jié)限制，但分裂相相對較少。此外，鮑染色體長度相對較小，很多種類核型差異不大，區(qū)分難度大。以上因素都限制了鮑科染色體研究的順利進行。

鮑的染色體研究相對于高等動物的相關(guān)研究還是比較匱乏和滯后的，除了染色體常規(guī)核型分析之外，染色體帶型和熒光原位雜交應(yīng)用主要局限于染色體C帶、NOR帶、端粒序列和rDNA定位方面的研究，大插入片段克隆的定位、遺傳連鎖圖譜在細胞遺傳圖譜上的定位在鮑科中沒有報道，染色體染色探針仍然缺乏。

隨著細胞遺傳學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，開展染色體研究的鮑物種的數(shù)目不僅會不斷增多，而且染色體研究的精細程度也會不斷加強。鮑染色體研究不再單單局限于核型、帶型的分析，染色體圖譜的繪制、高密度遺傳連鎖圖譜與染色體圖譜的整合、大片段基因組文庫和相關(guān)功能基因在染色體上定位等將逐步開展研究，進一步闡述鮑遺傳和系統(tǒng)進化機理。

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ResearchProgressonChromosomeinFamilyHaliotidae

GUO Zhansheng，HOU Xuguang

( College of Marine, Shandong University, Weihai 264209, China )

abalone; chromosome karyotype; chromosome banding; fluorescence in situ hybridization

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.05.025

S917.4

C

1003-1111(2016)05-0597-06

2015-10-15；

2016-03-10.

山東省科技發(fā)展計劃項目(2014GHY115014).

郭戰(zhàn)勝(1987-)，男，實驗員，碩士；研究方向：貝類遺傳育種.E-mail:guomarine@163.com.通訊作者：侯旭光(1963-)，男，副教授，博士；研究方向：發(fā)育生物學(xué).E-mail:richardhoukk@163.com.