茴魚微衛(wèi)星標記開發(fā)及保護遺傳學研究進展

劉云國，劉凌霄，王詠星

(1.新疆大學 生命科學與技術(shù)學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.臨沂市農(nóng)業(yè)科學院，山東 臨沂 276012)

茴魚微衛(wèi)星標記開發(fā)及保護遺傳學研究進展

劉云國1，劉凌霄2，王詠星1

(1.新疆大學 生命科學與技術(shù)學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.臨沂市農(nóng)業(yè)科學院，山東 臨沂 276012)

茴魚；微衛(wèi)星標記；遺傳多樣性；系統(tǒng)發(fā)育學

茴魚 (Thymallus)隸屬于鮭形目、鮭科、茴魚亞科，是一類具有重要漁業(yè)價值的珍稀名貴冷水性魚類[1-2]。目前已知該屬魚類主要有分布于歐洲的歐洲茴魚(T.thymallus)、分布于北美洲的北極茴魚(T.arcticus)和亞洲北部的其他茴魚種和亞種。其中，亞洲東北部是茴魚物種多樣性最豐富的地區(qū)。在東西伯利亞地區(qū)的貝加爾湖、勒拿河、葉尼塞河及其他環(huán)北冰洋河流水系中分布有貝加爾茴魚(T.baicalensis)、東西伯利亞茴魚(T.pallasii)、勒拿河茴魚(Thymallussp.)等。該屬在黑龍江流域中國境內(nèi)分布有3個種，分別為黑龍江茴魚 (T.grubii)、下游黑龍江茴魚(T.tugarinae)，以及后期發(fā)現(xiàn)的一個北極茴魚亞種(T.arcticusssp.)[3-4]。另外，在整個黑龍江水系還分布有布列亞茴魚(T.burejensis)及黃斑茴魚(T.grubiiflavomaculatus)等。新發(fā)現(xiàn)的北極茴魚亞種在黑龍江水系僅分布于上游區(qū)域的呼瑪河、額木爾河等支流，地理分布范圍狹小，種群數(shù)量較少[5]。新疆北極茴魚(T.arcticusgrubei)屬于北極茴魚的一個亞種，野生資源主要分布在新疆額爾齊斯河的上游各支流如葉爾特斯河、庫依爾特斯河、克蘭河、喀依爾特斯河、喀拉額爾齊斯河等地[6-7]。由于茴魚對生活環(huán)境要求比較苛刻，生存能力比較脆弱，種群資源容易受到外界環(huán)境變化和人類活動的影響。目前，正面臨著第六次淡水魚類的滅絕危機時代，世界范圍內(nèi)茴魚分布區(qū)域逐漸縮小，種群資源已經(jīng)嚴重衰退[8]。因此，筆者綜述了茴魚屬魚類在微衛(wèi)星標記開發(fā)、遺傳變異分析、遺傳多樣性評價及系統(tǒng)地理學等保護遺傳學方面的研究進展，以期為該屬魚類的進一步研究提供指導，更好的保護其自然資源。

1 茴魚微衛(wèi)星標記開發(fā)研究

微衛(wèi)星標記作為一種共顯性遺傳標記，可鑒別純合子和雜合子；具有豐富的多態(tài)性和良好的重復性，比其他顯性分子遺傳標記如AFLP、RAPD、ISSR等具有更強的遺傳檢測能力。近十幾年來，水產(chǎn)生物微衛(wèi)星標記的開發(fā)一直是研究的熱點，因為微衛(wèi)星標記不僅能為遺傳多樣性研究、種群結(jié)構(gòu)分析、個體識別、遺傳圖譜構(gòu)建等奠定基礎(chǔ)，同時也能對野生資源開發(fā)以及遺傳育種工作提供可利用的遺傳資料。當前，獲取微衛(wèi)星的方法主要有基因組富集文庫法、近緣種雜交擴增法、基因組和cDNA數(shù)據(jù)庫篩選法、基于RAPD、AFLP、ISSR等擴增序列的篩選法和基于第二代測序技術(shù)的全基因組篩選法等。Koskinen等[9]通過雜交擴增的方法，發(fā)現(xiàn)鮭魚中部分微衛(wèi)星標記在歐洲茴魚和北極茴魚能夠通用。Snoj等[10-12]首先從歐洲茴魚中直接開發(fā)了8個特異微衛(wèi)星標記：BFRO004、BFRO014、BFRO015、BFRO016、BFRO017、BFRO018、BFRO010和BFRO011。Koskinen等[13]利用鮭科魚類和歐洲茴魚中的17個微衛(wèi)星位點研究了微衛(wèi)星引物在北極茴魚中的雜交擴增情況，發(fā)現(xiàn)大部分位點在北美北極茴魚中能產(chǎn)生擴增和多態(tài)性。Vasemaji等[14]通過大西洋鮭(Salmosalar)中75條EST微衛(wèi)星標記的雜交擴增，發(fā)現(xiàn)部分位點在歐洲茴魚等其他5種魚類中擴增成功。Diggs等[15]從北美北極茴魚中開發(fā)了12條微衛(wèi)星標記，并在黑龍江茴魚、布列亞茴魚、歐洲茴魚等幾個種及亞種間顯示了一定的擴增通用性。Junge等[16]通過構(gòu)建微衛(wèi)星富集DNA文庫，從歐洲茴魚中篩選到了19個微衛(wèi)星位點，發(fā)現(xiàn)部分微衛(wèi)星標記能夠在北美北極茴魚、北極紅點鮭(Aphanomycesinvadans)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭中雜交擴增。表1列出了目前從茴魚屬魚類直接開發(fā)的微衛(wèi)星標記。

表1 從茴魚屬魚類直接開發(fā)的微衛(wèi)星標記

2 茴魚遺傳多樣性及系統(tǒng)地理學研究

物種的遺傳多樣性是生命進化和物種分化的基礎(chǔ)，為環(huán)境改變引起的適應性反應提供了必要的基因型。它可以賦予某一群體適應環(huán)境改變、環(huán)境壓力和抵抗病菌、病毒的能力[17]。最大限度地維持種內(nèi)遺傳多樣性水平，是保證其遺傳潛力和持續(xù)利用種質(zhì)資源的前提?；蜃儺愒截S富，雜合度越高，對環(huán)境的適應能力就越強，在生長、繁殖力和抗逆性等經(jīng)濟性狀上也更有優(yōu)勢。目前，微衛(wèi)星標記和線粒體測序技術(shù)廣泛應用到了茴魚屬魚類的遺傳變異、遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及保護遺傳學研究中，其中，以歐洲茴魚、北極茴魚、黑龍江茴魚和下游黑龍江茴魚開展的研究工作較多，它們都為這些茴魚遺傳多樣性評價和遺傳資源的保護提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

2.1 歐洲茴魚

2.2 北極茴魚

在北極茴魚的研究上，Lynch等[39]率先利用形態(tài)學標記和蛋白質(zhì)電泳等生化標記研究了北美北極茴魚的遺傳變異和遺傳分化。隨后，Redenbach等[40]從動物地理學的角度上研究了北美北極茴魚線粒體DNA的變異情況。Stamford等[41]利用mtDNA-RFLPs和微衛(wèi)星標記分析了北美北極茴魚系譜發(fā)育地理學，包括它的分化、起源及同歐亞茴魚的親緣關(guān)系。隨后，Stamford等[42]又利用7個微衛(wèi)星標記研究了加拿大不列顛哥倫比亞省安寧河流域一帶11個北極茴魚個體的微衛(wèi)星位點變異情況，目的是分析北極茴魚群體的亞結(jié)構(gòu)河評價水電站的建立對群體大小的影響。Weiss等[43]通過測定12個表型特征數(shù)據(jù)和線粒體控制區(qū)DNA測序研究了勒拿河及周邊北極水系北極茴魚兩個主要地理譜系的表型和遺傳差異。Yasuike等[44]通過測定北極茴魚和歐洲茴魚的線粒體DNA序列，從整個線粒體基因組水平上研究了它們同其他鮭科魚類的系統(tǒng)進化關(guān)系。我國學者馬波等[3]首先在黑龍江流域鑒定了一個北極茴魚亞種。隨后，孫家賢等[45]利用微衛(wèi)星標記對包括黑龍江北極茴魚亞種在內(nèi)的3種茴魚的遺傳多樣性進行了比較研究，探討了其種群遺傳結(jié)構(gòu)、分化水平及分類學地位，為制定保護管理策略提供了遺傳學理論依據(jù)。馬波等[5]利用線粒體D-loop基因序列分析了黑龍江上游北極茴魚亞種的群體遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明遺傳多樣性較低，單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性遠低于同域分布的其他種茴魚。Reilly[46]從加拿大艾伯達地區(qū)的干草河、和平河、阿薩巴斯卡河的40個地點捕獲北極茴魚1116尾，利用微衛(wèi)星標記進行了群體遺傳學和景觀遺傳學研究，發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性由南至北逐漸衰退，其中養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性最低。

2.3 黑龍江茴魚和下游黑龍江茴魚

針對黑龍江茴魚和下游黑龍江茴魚，利用微衛(wèi)星標記和線粒體測序技術(shù)，也開展了較多研究工作。Froufe等[47]早前開展了東西伯利亞地區(qū)黑龍江茴魚的形態(tài)和遺傳變異研究。Knizhin等[48]利用形態(tài)學標記和線粒體控制區(qū)測序研究了俄羅斯境內(nèi)黑龍江茴魚的形態(tài)學和遺傳學多樣性。除此之外，我國學者馬波等[49]在該方面做了大量研究工作，在中國境內(nèi)黑龍江水系的鳥蘇里江、呼瑪河、額木爾河等河流采集到茴魚屬魚類標本，經(jīng)鑒定為中國一新紀錄種即下游黑龍江茴魚。馬波等[1]根據(jù)線粒體DNA基因序列變異分析顯示鴨綠江茴魚為黑龍江茴魚同物異名，由于茴魚屬內(nèi)各種、亞種之間的區(qū)分及命名比較混亂，該項研究進一步規(guī)范了茴魚屬魚類的定名。馬波等[50]利用微衛(wèi)星標記對烏蘇里江、黑龍江上游的呼瑪河和額木爾河3個下游黑龍江茴魚地理種群的遺傳多樣性進行了比較研究。孫家賢等[45]利用微衛(wèi)星標記對采自黑龍江上游呼瑪河同域分布的黑龍江茴魚、下游黑龍汀茴魚及北極茴魚亞種3種茴魚進行了種群遺傳結(jié)構(gòu)研究，并比較其遺傳多樣性。馬波等[3]基于茴魚屬魚類的線粒體D-loop片段全序列變異，對分布于黑龍江上游中國境內(nèi)的呼瑪河、額木爾河等水系中形態(tài)特征差異顯著且同域分布的3種茴魚進行了分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究，綜合3種茴魚在黑龍江水系的地理分布現(xiàn)狀，對其起源及演化進行了初步推測。Ma等[51]通過測定線粒體控制區(qū)DNA序列分析了黑龍江流域黑龍江茴魚的系統(tǒng)地理學和群體遺傳結(jié)構(gòu)。Semenchenko等[52]利用線粒體cyt b基因測序數(shù)據(jù)比較分析了遠東地區(qū)下游黑龍江茴魚及黃斑茴魚的遺傳分歧。目前，Zhao等[53-54]已完成了黑龍江茴魚線粒體DNA的測序工作，全長約16.7 kb，包含13個蛋白質(zhì)基因，22個tRNA基因和2個核糖體基因，為茴魚遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析提供了更多DNA序列選擇。

3 茴魚遺傳學研究存在的問題及解決途徑

目前茴魚中開發(fā)的微衛(wèi)星標記相對較少，已經(jīng)開發(fā)的微衛(wèi)星位點主要集中在歐洲茴魚和北美北極茴魚，其他一些茴魚種和亞種尚未見有微衛(wèi)星標記開發(fā)的報道。而且很多位點是通過相近物種雜交擴增獲得，應用到茴魚上時不可避免的會出現(xiàn)多態(tài)性及擴增穩(wěn)定性的降低。這些微衛(wèi)星標記還遠不能滿足茴魚遺傳圖譜構(gòu)建、微地理群體的遺傳結(jié)構(gòu)評價及優(yōu)良性狀QTL精細定位等進一步遺傳學研究的要求。Koskinen等[55]通過歐洲茴魚的試驗證明了將更多的微衛(wèi)星位點應用到群體遺傳學上的優(yōu)勢，如果微衛(wèi)星位點較少的話，會導致群體進化關(guān)系分析錯誤的發(fā)生。因而，開發(fā)更多的微衛(wèi)星標記，特別是針對歐洲茴魚和北美北極茴魚以外其他茴魚種和亞種開發(fā)特異微衛(wèi)星標記很有必要。

近年來，遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建是水產(chǎn)遺傳學研究的熱點領(lǐng)域，很多水產(chǎn)動物的遺傳連鎖圖譜已經(jīng)建立。遺傳連鎖圖譜是通過遺傳重組交換結(jié)果進行連鎖分析所得到的基因在染色體上相對位置的排列圖。它是實現(xiàn)數(shù)量性狀基因定位、分子標記輔助選育和遺傳改良的基礎(chǔ)。開展遺傳連鎖圖譜構(gòu)建工作對于茴魚遺傳多樣性保護和資源開發(fā)都具有重要的意義。然而，由于茴魚遺傳背景基礎(chǔ)研究工作比較薄弱，遺傳連鎖圖譜構(gòu)建工作困難重重，主要原因在于茴魚作為水產(chǎn)動物不像農(nóng)作物那樣可以方便地建立并維持較大的作圖群體。解決的途徑就是利用雙假測交法和單配子PCR分型技術(shù)進行遺傳連鎖圖譜構(gòu)建?；贔1群體作圖的擬測交理論，僅需兩代系譜的材料可以在較短的時間內(nèi)建立做圖群體。同時，可以避免顯性標記無法區(qū)分顯性純合個體和雜合個體的問題。單配子PCR分型技術(shù)是構(gòu)建連鎖圖譜的有效方法，在遺傳圖譜構(gòu)建中顯示了廣闊的應用前景。該方法解決了家系分析法世代間隔長，后代數(shù)目少，多態(tài)信息含量低的缺點。由于微衛(wèi)星是共顯性遺傳，對親本的擴增結(jié)果易于找到雜合位點，可應用雜合微衛(wèi)星標記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。單配子PCR分型技術(shù)應用于茴魚具有獨到的優(yōu)點，因為茴魚的家系分析較為困難，但茴魚的單配子易獲得，單個卵子分型技術(shù)尤其適合于茴魚的遺傳圖譜構(gòu)建。

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A Review:Research Progress of Development of Microsatellite Markers and Conservation Genetics in Grayling

LIU Yunguo1, LIU Lingxiao2, WANG Yongxing1

(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urümqi 830046, China;2.Linyi Academy of Agricultural Sciences, Linyi 276012, China

grayling; microsatellite marker; genetic diversity; phylogenetics

S917

C

1003-1111(2016)01-0087-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.016

2015-04-10；

2015-07-29.

新疆自治區(qū)自然科學基金資助項目(2015211C261).

劉云國(1977-)，男，博士，教授級高級工程師；研究方向：水產(chǎn)生物技術(shù). E-mail: yguoliu@163.com.