蕓薹屬作物遠緣雜交子房離體培養(yǎng)的研究進展

賈思齊，王 超

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，黑龍江哈爾濱 150030）

蕓薹屬（Brassica）作物在世界范圍內(nèi)大約有100多種，其中我國有15種、11種變種和1個變型[1]，包括重要的蔬菜、油料、香料和藥用植物，如青花菜、油菜、甘藍、芥菜等，此屬在十字花科作物中是最具有經(jīng)濟價值的一類，其在國內(nèi)外受到了廣大學者的青睞。遠緣雜交是指在不同種、屬以及更遠親緣關(guān)系之間的雜交，通過遠緣雜交可以獲得抗病蟲害、高光和效率、抗寒、耐旱等優(yōu)良特性，其在蕓薹屬作物育種中也得到了廣泛的應用。但由于雜交障礙是遠緣雜交的普遍現(xiàn)象，胚乳不能正常發(fā)育致使雜種胚得不到充足的養(yǎng)料而餓死，采用常規(guī)的人工雜交很難得到雜種種子。自Inomata首次報道采用子房培養(yǎng)技術(shù)獲得了種間雜種以來，很多研究者相繼采用子房離體培養(yǎng)技術(shù)成功獲得了遠緣雜交種子[2-4]。子房離體培養(yǎng)技術(shù)操作簡單，可在短時間內(nèi)提高雜交效率，加快育種進程，縮短育種年限，是蕓薹屬植物遠緣雜交獲得種子的重要手段。本文擬對蕓薹屬植物遠緣雜交子房離體培養(yǎng)的影響因素、再生植株的雜種鑒定和染色體加倍等研究成果作如下的概述。

1 影響蕓薹屬雜種子房離體培養(yǎng)的因素

蕓薹屬植物遠緣雜交雜種子房離體培養(yǎng)受供體植株的基因型、雜交組合、培養(yǎng)基和授粉后取材培養(yǎng)的最佳時間等因素的影響。

1.1 雜交植株的基因型

供體植株的基因型對遠緣雜交子房離體培養(yǎng)的發(fā)生具有決定性的作用，供體親本的不同基因型對作物產(chǎn)生的影響因作物不同而有顯著差異[5]。王幼平等對海甘藍與蕓薹屬屬間雜交的親和性研究發(fā)現(xiàn)，以海甘藍為父本與同類型油菜中的不同基因型品種作母本進行雜交，其在受精親和性上存在一定差異[6]。劉運霞等以小白菜雄性不育系為母本，花椰菜自交系為父本進行種間雜種離體子房培養(yǎng)，結(jié)果表明培養(yǎng)效果因父本花椰菜基因型的不同而不同[7]。周清元等利用不同基因型的羽衣甘藍與白菜型油菜雜交可提高人工合成甘藍型油菜的效率，通過子房離體培養(yǎng)表明其效率與父本的基因型有關(guān)[8]。Lu等在甘藍與白菜的種間雜交得出了父本基因型對雜種率起著決定性作用[9]。在遠緣雜交中父本作為供體，其基因型可能更多地決定著子房培養(yǎng)成功的機會。

1.2 雜交組合

王愛云等研究表明在以諸葛菜為父本的正交組合中，子房離體培養(yǎng)提高了獲得雜交種子的頻率。在以諸葛菜為母本的反交組合中，無論是子房離體培養(yǎng)還是田間培養(yǎng)，均沒有獲得飽滿種子[10]。與此同時，Inomata的研究結(jié)果也表明子房離體培養(yǎng)能有效地提高白菜×甘藍的正交組合雜種獲得率，而對于甘藍×白菜反交的組合培養(yǎng)效果甚微[2]。滿紅等通過4×菜薹與4×芥藍種間雜交，借助于子房培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，以4×菜薹為母本授粉后的子房經(jīng)離體培養(yǎng)均有存活的胚珠，而以芥藍為母本時，無論培養(yǎng)授粉幾天的子房，沒有存活的胚珠[11]。M Leflon在以羽衣甘藍為母本與白菜型油菜雜交，沒有得到籽粒；但以白菜型油菜為母本與其羽衣甘藍雜交時，通過子房培養(yǎng)后收獲到了真正的雜種[12]。Müntzing認為種子的形成與母本、胚乳和胚這3種組織有關(guān)，三者在染色體數(shù)上必須是母本組織：胚乳：胚的比例為2∶3∶2，當上述三者的正常比例因倍數(shù)發(fā)生變化時，就會導致種間雜交敗育情形[13]。Watkins又提出母本與胚乳的比例為2∶3時，即采用染色體數(shù)目高的一方作為母本遠緣雜交可使種子正常發(fā)育[14]。

1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是影響蕓薹屬遠緣雜交子房離體培養(yǎng)的重要因素，在一些作物子房離體培養(yǎng)的過程中，選擇合適的培養(yǎng)基類型、植物激素的種類、水平和配比及碳源的種類和濃度等諸多因素，是決定其培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵[15-17]。

Inomata等研究小白菜與羽衣甘藍種間雜種子房離體培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)在 MS、B5、White、Heller 和Nitsch 5種培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)的基培養(yǎng)效果最好[18]。但梁紅等利用白菜與甘藍的種間雜時，表明在White培養(yǎng)基上雜交子房培養(yǎng)獲得良好的效果[19]。唐征等以甘藍型油菜與青花菜種間雜種子房離體培養(yǎng)試驗，通過MS培養(yǎng)基與White培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基更適合其培養(yǎng)。而在進行白菜型油菜和諸葛菜的雜交子房培養(yǎng)時也得到了同樣的結(jié)果，MS培養(yǎng)基優(yōu)于B5培養(yǎng)基，其對于雜交子房離體培養(yǎng)效果較好[20]。

何丹等通過對紅菜薹與甘藍型油菜的離體子房培養(yǎng)結(jié)果表明，采用MS+（1.0～2.0）mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+0.5%活性炭+30 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂培養(yǎng)基對其雜交子房培養(yǎng)效果較為理想；相對于培養(yǎng)基和激素，活性炭對子房培養(yǎng)的影響更加顯著[21]。祝朋芳等研究表明，外源激素及其配比對子房離體結(jié)實具有極顯著影響，以BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L最佳，結(jié)籽率為9%；其次為BA2 mg/L+NAA0.2 mg/L，結(jié)籽率為3%；BA2 mg/L+NAA 0.3 mg/L及無激素MS培養(yǎng)基上均未獲得飽滿種子[22]。張國慶等通過子房培養(yǎng)的方法獲得白菜型油菜與甘藍雜交再生苗發(fā)現(xiàn)，在MS基本培養(yǎng)基上添加1.0 mg/L的BA和0.1 mg/L的NAA對再生苗生根效果最好[23]。殷家明等對白菜型油菜×羽衣甘藍子房培養(yǎng)研究表明，MS基本培養(yǎng)基添加0.2 mg/L NAA，1.0或2.0 mg/L BA和7%蔗糖時對其結(jié)籽促有進作用，結(jié)籽率較高；而在B5基本培養(yǎng)基上添加相同的激素則有抑制結(jié)籽作用[24]。因此，為了提高子房離體培養(yǎng)的成功效率，應針對每一個雜交組合的特性選擇相應的培養(yǎng)基。

1.4 授粉后取材培養(yǎng)的最佳時間

授粉后子房取材培養(yǎng)最佳時間的選擇決定其子房的存活率。Wen等利用小白菜和花椰菜雜交子房離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)授粉第7 d的效果最好[25]。王愛云等對白菜型油菜與諸葛菜遠緣雜交中發(fā)現(xiàn)自然條件下沒有獲得種子，但取授粉后第7 d的子房進行培養(yǎng)，其存活率和結(jié)籽率較高[10]。張國慶等發(fā)現(xiàn)在白菜型油菜和甘藍雜交子房離體培養(yǎng)時，取授粉后第9 d的子房培養(yǎng)獲得的種子最多，結(jié)籽率最高[26]。祝朋芳等以大白菜與羽衣甘藍CMS種間雜種G3與羽衣甘藍回交研究表明，授粉后9 d的子房培養(yǎng)效果最佳[22]。鞏振輝等通過白菜與白芥進行屬間雜種子房培養(yǎng)技術(shù)研究，結(jié)果表明授粉后6～8 d的雜種子房離體培養(yǎng)最好，獲得的雜種種子最多，種子發(fā)芽率也最高[27]。張小玲等在甘藍型油菜與花椰菜子房離體培養(yǎng)的研究中，得出培養(yǎng)授粉后12 d的雜種子房效果最好[28]。何丹等通過甘藍型油菜和紅菜薹雜交發(fā)現(xiàn)授粉后15 d為子房對雜交子房培養(yǎng)結(jié)籽率和雜種萌發(fā)率最高[21]。唐征等利用甘藍型油菜與青花菜種間雜種子房離體培養(yǎng)研究結(jié)果表明：授粉后15 d的子房培養(yǎng)效果最好[20]。周清元等用不同基因型的羽衣甘藍和白菜雜交進行子房培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)授粉后15 d左右效果較理想[8]。因雜交組合的不同會直接影響子房培養(yǎng)取材時期的差異，因此，過早或過晚培養(yǎng)授粉后的離體子房都不利于雜種種苗的獲得。

2 真假雜種的鑒定

2.1 形態(tài)學鑒定法

于海龍等通過芥藍與甘藍型油菜種間雜交經(jīng)形態(tài)學觀察F1單株形態(tài)特征總體介于兩親本之間，植株營養(yǎng)生長旺盛，呈現(xiàn)超親優(yōu)勢[29]。趙志剛等利用常規(guī)雜交子房離體培養(yǎng)獲得的雜種F1代植株，形態(tài)上表現(xiàn)為中間類型[30]。郭曉芹等在進行大白菜與花椰菜雜交時發(fā)現(xiàn)，異源四倍體和三倍體的株幅、株高、葉片長等性狀較雙親有很大差別，而且大多數(shù)表型性狀大于雙親，表現(xiàn)出超親優(yōu)勢[31]。喬海云等以菜薹-青花菜異源雙二倍體為橋梁與菜薹雜交獲得了異源三倍體，其形態(tài)特征介于菜薹與青花菜之間，生長較旺盛[32]。形態(tài)學鑒定在實際操作上簡單易行，但主觀性強較容易受到人為因素的影響，因此還需結(jié)合其他方法進行真實有效地鑒定。

2.2 細胞學鑒定法

趙志剛等通過細胞學方法，鑒定了青海大黃油菜與黑芥雜種子房離體培養(yǎng)獲得的F1代植株的細胞染色體數(shù)為18條，染色體數(shù)是母本青海大黃油菜（2n=AA=20）和父本黑芥（2n=BB=16）的配子之和[30]。喬海云等通過細胞學驗證了大白菜與紫甘藍種間雜交獲得的雜種是真實的[33]。江瑩芬等用細胞學對埃塞俄比亞芥和白菜型油菜遠緣雜交的F1的染色體觀察表明，染色體數(shù)為27條為真雜種，染色體數(shù)為34條為假雜種[34]。郭曉芹等根據(jù)大白菜與結(jié)球甘藍雜交子房壓片方式，發(fā)現(xiàn)異源四倍體的不同植株細胞染色體均為2n=38，而異源三倍體植株的細胞染色體數(shù)均為2n=29，異源四倍體植株包含了母本的兩個染色體組和父本的兩個染色體組，異源三倍體則包含了母本的兩個染色體組和父本的一個染色體組[35]。張國慶等對子房離體培養(yǎng)的再生植株根尖進行染色體壓片觀察，結(jié)果表明，鑒定的9株植株中的單倍體染色體數(shù)目均為19，即再生植株的染色體數(shù)是白菜型油菜與甘藍染色體的總和[26]。細胞學可以真實有效地鑒定雜交種的真?zhèn)危毎麑W標記有限，易受人為因素的影響加之蕓薹屬作物的染色體數(shù)目多且染色體小，因此僅用細胞學觀察鑒定具有一定難度。

2.3 分子鑒定法

于海龍利用SSR標記輔助技術(shù)對芥藍與甘藍型油菜的45株BC1植株進行鑒定，其中35株為真雜種，10株為假雜種[29]。郭曉芹等利用SPAP分子標記對親本及多倍體進行鑒定發(fā)現(xiàn)，異源多倍體中可同時擴增出母本與父本的特異性條帶，是大白菜與花椰菜的雜交種[35]。趙志剛等也利用SSR技術(shù)對7株F1雜種植株鑒定，結(jié)果表明雜交得到的F1雜種植株同時具有父、母本的特征帶，為真雜種[30]。王愛云等用SSR引物S82294對白菜型油菜和諸葛菜雜交的25株子房離體培養(yǎng)的F1再生植株進行雜種真?zhèn)蔚蔫b定，擴增結(jié)果表明，分別以母本澧臨白菜和湖北白菜以及父本諸葛菜DNA為模板，引物S82294能夠穩(wěn)定、清晰的擴增出200 bp和230 bp的條帶，而用25株F1再生植株DNA為模板，僅1株擴增出既有母本230 bp又有父本200 bp的雙親互補型條帶，因此認為該再生植株為真雜種，其余24株為偽雜種，將其剔除[10]。分子標記法具有擴增穩(wěn)定、檢測容易、多態(tài)性好及通用性強等特點，可以在子房離體培養(yǎng)獲得再生植株苗期進行真假雜種的鑒定，為其早期培養(yǎng)選擇提供了一種真實可靠的檢測方法。

3 再生植株的加倍

子房離體培養(yǎng)和染色體加倍已成為獲得蕓薹屬新物種的重要途徑，同時對遠緣雜種的保存和利用具有非常重要的意義。蕓薹屬植物獲得的再生植株加倍方法有人工加倍和自然加倍兩種，為了獲得優(yōu)良的目的性狀，一般采用秋水仙素處理實現(xiàn)人工加倍，Choudhary等將母本Raphaanus candatus與父本B.tournefortii雜交，利用秋水仙堿人工加倍獲得了異源雙二倍體Rapha-nofortii植株，其結(jié)實性和可育率隨著世代的提高逐漸增強[36]。陳洪高等利用何慶蘿卜與白花芥藍雜交，用秋水仙素使F1幼苗染色體加倍獲得了蘿卜-芥藍異源四倍體[37]。Paulmann等用蘿卜和甘藍屬間雜種為實驗材料，通過秋水仙素加倍手段獲得異源四倍體，再以該異源四倍體為橋梁與甘藍型油菜雜交，成功地將蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育基因以及恢復基因轉(zhuǎn)移到了甘藍型油菜中[38]。孫龍濤以白菜和黑芥為材料，通過種間雜交和采用0.2%濃度的秋水仙素人工誘導染色體加倍得到了6株異源四倍體和3株非整倍體[39]。Li等利用甘藍和甘藍型油菜為材料雜交并加倍后獲得的六倍體為橋梁，進而得到了新型甘藍型油菜[40]。周清元等通過羽衣甘藍和芥菜型油菜種間雜交獲得三倍體再生植株，以100 mg/L秋水仙素處理子房離體培養(yǎng)獲得六倍體新物種，該雜種植株花瓣大且顏色深，花藥飽滿生長勢較強[41]。子房離體培養(yǎng)及其染色體加倍已成為獲得新種質(zhì)資源的重要途徑，多倍體可作為橋梁與蕓薹屬雜交得到新物種，通過這種方式不僅避免雜交的不親和性，還可以將不同基因組信息滲入到其他作物中去，大大拓寬了蕓薹屬植物的遺傳基礎(chǔ)。

4 存在的問題與展望

利用子房離體培養(yǎng)克服了遠緣雜交受精后胚胎發(fā)生障礙，獲得了蕓薹屬較遠親緣關(guān)系屬、種間雜交的再生植株，為進一步選育出新的品種奠定基礎(chǔ)，是改良現(xiàn)有蕓薹屬植物品種的重要手段。目前還有兩個方面的研究值得深入：第一，雜交子房離體培養(yǎng)獲得再生植株還受到親本基因型和雜交組合的影響，關(guān)于遠緣雜交可交配遺傳機理方面的研究較少。第二，離體子房的早期發(fā)育對培養(yǎng)基要求十分嚴格，普通的MS培養(yǎng)基無法滿足其生長需求，因而子房離體培養(yǎng)很難成功；而授粉后過于延長在母本上發(fā)育的天數(shù)，由于雜種核和卵細胞質(zhì)的代謝或胚胎與胚乳發(fā)育的不協(xié)調(diào)增加，導致雜種胚缺乏營養(yǎng)而餓死，而關(guān)于胚胎發(fā)育生理學和細胞胚胎學機理等方面的研究也需要進一步的完善。目前子房離體培養(yǎng)的研究還處于初步階段，隨著以后大量的研究探索，結(jié)合遠緣雜交不親和性的機理，建立更加有效的屬間、種間子房培養(yǎng)體系，提高蕓薹屬植物遠緣雜交子房培養(yǎng)的成功率。

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