轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠血相、血生化、血液粘度的影響

湯亞飛+李超民+胡吉林

摘要：將轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈粉與小鼠普通飼料成分按質(zhì)量比1∶3混合喂養(yǎng)小鼠90 d，探討轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠血相、血生化、血液粘度的影響。結(jié)果表明：試驗組和對照組小鼠的血相、血生化和血液流變學(xué)等相關(guān)指標均差異不顯著。由此證明轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠無毒副作用，該秸稈可安全地作為牛等家畜動物的越冬飼料。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈；小鼠；血相；血生化；血液粘度

中圖分類號：S816.35 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）11-0129-05

Abstract The rats were fed with mixed feeds composed of straw powder of Bt transgenic rice and ordinary forage with the mass ratio of 1∶3 to study the effects of Bt transgenic rice straw on hemogram， blood biochemistry and blood viscosity. The results indicated that there was no significant difference on several parameters including hemogram， blood biochemistry and hemorheology between treatment group and control. In conclusion， the Bt transgenic rice straw had no negative effects on rats and could be used as overwintering feeds for livestock like cow.

Keywords Bt transgenic rice straw； Rat； Hemogram； Blood biochemistry； Blood viscosity

水稻是全球主要糧食作物，現(xiàn)有100多個國家種植，其中亞洲的產(chǎn)量占世界水稻總產(chǎn)量的92%，而我國就占世界稻谷產(chǎn)量的31%[1]。然而，水稻在種植過程中因長期遭受病蟲害的嚴重侵襲而造成大量減產(chǎn)。為保證高產(chǎn)豐收，人們大量使用化學(xué)農(nóng)藥等傳統(tǒng)防治方法殺滅害蟲。雖然這給人類帶來了糧食增產(chǎn)，但嚴重破壞了生態(tài)平衡，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)退化，稻谷農(nóng)藥殘留超標，嚴重威脅人畜健康[2]。所以，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)科學(xué)地解決這一問題就顯得尤為重要，轉(zhuǎn)Bt基因水稻也應(yīng)運而生。

Bt蛋白是由廣泛分布于土壤中的革蘭氏陽性細菌所表達的蛋白，該細菌的芽孢在形成過程中會產(chǎn)生一種伴孢晶體蛋白（insecticidal crystal protein，簡稱ICPs），此蛋白針對鞘翅目和鱗翅目昆蟲具有一定殺蟲活性[3]。為使植物細胞能合成ICPs，從而使其具有抗蟲特性，可以通過從蘇云金芽孢桿菌中分離出Bt蛋白的編碼基因ICPs并導(dǎo)入植物中，目的是為了更好地利用這種天然殺蟲資源，這是迄今全球應(yīng)用最廣泛的殺蟲措施之一[4]，轉(zhuǎn)Bt基因水稻就是通過這種方式獲得。轉(zhuǎn)Bt基因水稻抗蟲蛋白的表達能夠減少農(nóng)藥施用量，在我國糧食安全保障中具有重要地位[5]。2009年，我國轉(zhuǎn)Bt基因作物種植面積約為0.38億公頃，居世界第五位[6]。我國轉(zhuǎn)Bt基因水稻于1998年開始在田間試驗，目前正處在安全評價階段。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)于2009年研發(fā)的轉(zhuǎn)CrylAb/CrylAc基因水稻華恢一號和“Bt汕優(yōu)63”已獲得國家安全證書，并獲準在湖北和山東兩省種植，即將進入商業(yè)化生產(chǎn)[7]。隨著轉(zhuǎn)Bt基因水稻的大面積種植，不可避免會有越來越多的轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈產(chǎn)生，而水稻秸稈在南方是牛等家畜動物越冬的重要飼料來源，因此對轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈的安全性評價就顯得格外重要。

本試驗將轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈和普通飼料成分按質(zhì)量比1∶3配制成轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈飼料，飼養(yǎng)小鼠90天，測定其血相、血生化和血液粘度三項血液參數(shù)，分析轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠血液的長期效應(yīng)，以期為轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈作為牛等家畜動物越冬飼料的安全評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 水稻秸稈 轉(zhuǎn)Bt基因水稻汕優(yōu)63的秸稈由湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 飼料 普通飼料，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司的B級小鼠飼料，許可證編碼為SCXK[湘] 2009-0009，主要營養(yǎng)成分：粗蛋白>20%，粗脂肪>4%，粗纖維<5%，粗灰粉<8%，含水量<10%，鈣 1.0%～1.8%，磷 0.6%～1.2%。

轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈飼料：將轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈進行超微粉碎，和普通飼料按質(zhì)量比1∶3均勻混合制備而成。

普通飼料和轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈飼料都保存在通風(fēng)、清潔、干燥的地方。

1.1.3 試驗動物與分組 3周齡SPF級昆明小鼠（ICR），購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，雌雄各30只，每只體重約16 g，上下浮動不超過2 g，許可證編碼為SCXK[湘]2013-0004。雌性和雄性均分試驗組和對照組，數(shù)量各半，試驗組以轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈飼料為食，對照組以普通飼料為食，其余飼養(yǎng)條件一致。飼養(yǎng)周期為90天，溫度為（23±2）℃。

1.1.4 儀器與試劑 Elisa試劑盒（南京建成），鑷子，注射器，載玻片，EP管，抗凝收集管，離心機（Eppendorf AG，German），超低溫冰箱，酶標儀（ELX800，Bio Tek Instruments Inc.，USA），全自動動物血液細胞分析儀（BC-2800，Mindray），全自動血流變儀（LBY-N6C，普利生），全自動生化分析儀（OLYMPUS，AU-400）。

1.2 試驗方法

1.2.1 Bt蛋白含量的測定 取干燥水稻秸稈1 g于研缽中，加適量液氮研磨，加入10 mL PBS充分溶解，取1 mL離心，將離心后的上清液用Elisa試劑盒測定秸稈中Bt蛋白含量。飼料中Bt蛋白含量的測定方法同上。

1.2.2 小鼠血相參數(shù)的測定 經(jīng)過90天飼養(yǎng)，從雌性和雄性的對照組和試驗組四組中分別隨機挑選5只小鼠，活鼠斷尾采血（只需一滴即可），將一滴血滴在潔凈的載玻片上，利用全自動動物血液細胞分析儀檢測白細胞數(shù)目、淋巴細胞數(shù)目等18項指標。逐只斷尾檢測，依次標記序號和組別。

1.2.3 小鼠血液粘度和生化參數(shù)的測定 喂養(yǎng)90天后，從雌性和雄性的對照組與試驗組四組小鼠中分別隨機挑選5只小鼠，脫頸處死，立即用鑷子摘除眼球采血。取1.5 mL全血加入到抗凝收集管，立即上下反復(fù)顛倒，使血液與管壁抗凝劑充分接觸，在18～25℃下靜置20 min，保證不含氣泡，加樣量必須高于1 mL，利用全自動血流變儀在37℃環(huán)境下測量血液粘度。剩下所有全血用2 mL EP管收集，3 000 r/min離心12 min，用注射器收集血清，標注標簽后放在冰箱-20℃冷凍儲存，備用。利用全自動生化分析儀測定總蛋白（TP）、堿性磷酸酶（ALP）等8項小鼠血清的生化指標。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗各項數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0軟件單因素ANOVA進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt蛋白含量的測定

經(jīng)測定得出Bt蛋白含量的標準曲線為y=0.0355x+0.1056，R2=0.9983，通過標準曲線計算出1 g轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈中Bt蛋白含量為534.461 ng，1 g轉(zhuǎn)Bt基因秸稈飼料中Bt蛋白含量為92.20657 ng。對照組飼料中未檢測到Bt蛋白。

2.2 轉(zhuǎn)Bt水稻秸稈對小鼠血相的影響

表1統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白細胞、紅細胞、淋巴細胞數(shù)目及平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量、紅細胞分布寬度變異系數(shù)、血小板分布寬度，無論雌性或雄性，試驗組均高于對照組；中性粒細胞數(shù)目、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比、紅細胞壓積，無論雌性或雄性，試驗組均低于對照組。但所有18個血相指標，試驗組與對照組間均無顯著性差異（P>0.05）?？傮w來看，轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠血液血相指標不產(chǎn)生明顯影響。

2.3 轉(zhuǎn)Bt水稻秸稈對小鼠血生化的影響

表2統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、ALT/AST、白蛋白比值這三項參數(shù)，無論雌性或雄性，試驗組都高于對照組，但是差異不顯著（P>0.05）；乳酸脫氫酶無論雌性或雄性，試驗組均低于對照組，但是差異不顯著（P>0.05）。

2.4 轉(zhuǎn)Bt水稻秸稈對小鼠血液粘度的影響

血漿濃度，雌性試驗組略微低于雌性對照組，雄性試驗組高于雄性對照組，但都不具有顯著性差異（P>0.05）。全血粘度，低切和中切條件下，相差很小，高切條件下，雌性試驗組高于雌性對照組，雄性試驗組略微低于雄性對照組，但都不具有顯著性差異（P>0.05）。具體見表3。

3 討論與結(jié)論

血常規(guī)檢查是臨床上最基礎(chǔ)的化驗檢查之一，能發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)量和形態(tài)的變化，常幫助發(fā)現(xiàn)全身性疾病的早期跡象，幫助臨床病情診斷[8]。血常規(guī)各項指標不僅可以直接診斷血液學(xué)疾病，也可間接推測機體組織器官的病變情況。血液中包含白細胞、紅細胞和血小板三大類功能細胞，對這三類細胞的分析是研究血液變化的重要基石。白細胞能夠吞噬入侵物質(zhì)并產(chǎn)生抗體抵抗病原菌，具有對疾病的免疫抵抗力、對病菌的抵御力和機體受傷后的恢復(fù)力。因此，白細胞數(shù)目（WBC）對于機體損傷、血液病變、器官中毒等都是非常重要的指示參數(shù)。本試驗結(jié)果表明，白細胞數(shù)目無論雌性或雄性，試驗組均略高于對照組，但均不具有顯著性差異，可推斷轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈不會引起小鼠血液病變。紅細胞數(shù)目（RBC）與紅細胞壓積（HCT）綜合分析可以共同鑒別紅細胞增多癥、減少癥或正常。本試驗結(jié)果表明， RBC與HCT兩個參數(shù)無論雌性或雄性，均不具有顯著性差異，說明轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈不會引起小鼠血液中紅細胞數(shù)目的變化。血紅蛋白濃度（HBG）是指示是否貧血的最重要參數(shù)，而平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細胞體積（MCV）、HCT、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）及紅細胞分布寬度變異系數(shù)（RDW）是關(guān)乎具體貧血類型的相關(guān)參數(shù)。本試驗結(jié)果表明， HBG、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW六個參數(shù)無論是雌性或者雄性，均不具有顯著性差異，可知，轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈不會引起小鼠貧血現(xiàn)象的發(fā)生。血小板（PLT）是維持生物體保持穩(wěn)定止血功能的重要因子，與平均血小板體積（MPV）和血小板分布寬度（PDW）聯(lián)合鑒別血小板增多癥、減少癥或正常。本試驗結(jié)果表明，關(guān)于PLT、MPV和PDW無論是雌性或者雄性，均不具有顯著性差異。由此可知轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠血小板不產(chǎn)生影響。

血液生化指標是毒理學(xué)研究中必不可少的檢測項目，田輝等[9]研究指出：血液學(xué)、血液生化指標是反映動物健康與否的重要而敏感的指標，根據(jù)血液學(xué)及其生化指標的改變及改變程度與劑量的關(guān)系，可以反映測試物影響動物病變的性質(zhì)和程度，是動物實驗中重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。血液生化指標各項參數(shù)的變化可指示遭受毒害或病害的相關(guān)器官?？偟鞍祝═P）是機體內(nèi)的蛋白混合物，是重要的運輸載體，具有維持滲透壓的功能，同時也是機體營養(yǎng)狀況的重要指標。肝實質(zhì)細胞能夠合成白蛋白（ALB），當肝臟受到損傷甚至產(chǎn)生病變，肝細胞便不能正常行使合成蛋白質(zhì)的功能，導(dǎo)致血漿中白蛋白含量隨之減少。機體在肝臟中可以合成膽固醇（TC），當肝臟病變時，膽固醇含量會下降。因此結(jié)合TP、ALB和TC可作為評價生物體營養(yǎng)狀況和肝功能的參數(shù)。本試驗結(jié)果表明，TP、ALB和TC無論是雌性還是雄性都不具有顯著性差異，可推斷轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠的營養(yǎng)狀況和肝功能均無不良影響。堿性磷酸酶（ALP）是一種磷酸單酯酶，大多分布于機體組織與體液里，而血清中ALP絕大部分來自骨骼、肝膽系統(tǒng)與腸道，是肝臟與骨骼問題的重要指示參數(shù)。本試驗結(jié)果表明， ALP無論是雌性還是雄性小鼠均不具有顯著性差異，可知轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠的骨骼和肝臟未造成影響。尿素（UREA）作為蛋白質(zhì)分解的終極產(chǎn)物之一，會經(jīng)過血液運輸達到腎小球，經(jīng)濾過作用后隨尿液排出體外，因此尿素也可以作為腎功能的一個重要指標。本試驗結(jié)果表明，UREA無論是雌性還是雄性小鼠均不具有顯著性差異，說明轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠的腎臟無毒害作用。谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）大多數(shù)位于肝臟中，當肝臟發(fā)生病變時，血清中AST的濃度會升高；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）大多數(shù)分布在肝細胞質(zhì)內(nèi)，它在細胞質(zhì)內(nèi)的濃度比血清中的濃度高幾千倍，1%的肝細胞死亡便可引起血清中ALT酶活增加一倍，因此ALT是肝功能損傷的最敏感指標；乳酸脫氫酶（LDH）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵代謝酶，可催化乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，在腎臟、肝臟和心臟中含量較高。本試驗結(jié)果表明，對于AST、ALT和LDH，無論是雌性還是雄性小鼠均不具有顯著性差異，可知轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠的肝臟無影響。

高血壓、血脂和糖尿病等疾病有個共同的病理基礎(chǔ)，那就是血液流變學(xué)的異常變化，作為血液流變學(xué)最重要的指標——血液粘度，與這些心腦血管疾病聯(lián)系異常緊密。血液粘度高低能反映血液循環(huán)優(yōu)劣或血液供應(yīng)多少，血液粘度增加，循環(huán)阻力升高，血流速度減慢，必然導(dǎo)致器官和組織尤其是微循環(huán)灌流量下降，造成缺血缺氧，影響組織的代謝和功能，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生[10]。因此血液粘度這個血液流變學(xué)的重要指標也是動物毒理學(xué)研究的一個重要參數(shù)。高切全血粘度值是在紅細胞形變作為血液流動的主導(dǎo)因素下的測定值，低切全血粘度值是在紅細胞匯聚作為血液流動的主導(dǎo)因素下的測定值。本試驗結(jié)果表明，全血粘度、低切全血粘度和高切全血粘度，雌性和雄性的試驗組與對照組都不具有顯著性差異，說明轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對紅細胞的形變與聚集沒有影響，這與血相中紅細胞指標結(jié)果互相映證。血漿粘度在某種程度上可以說決定了全血粘度，前者的增加會直接使后者也增加。并且血漿粘度是恒定的常數(shù)，不隨切變率的改變而改變。本試驗結(jié)果表明，無論是雌性還是雄性血漿粘度都不具有顯著性差異，可見轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠的血液粘度無影響。

綜上，經(jīng)過90天飼喂，小鼠無論是雌性還是雄性，在血相、血生化和血液粘度方面，轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對其均無顯著影響，說明轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈對小鼠血液的長期效應(yīng)沒有影響，由此證明轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈可以作為牛等家畜動物的越冬飼料使用。

參 考 文 獻：

[1] OECD. Series on the safety of novel foods and feeds [R]//Consensus document on compositional considerations for new varieties of rice （Oryza saliva）：key food and feed nutrients and antinutrients.2004.

[2] 汪洋. 轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對小鼠安全性的影響[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[3] 喻子牛.蘇云金桿菌[M].北京：北京科學(xué)出版社，1990：229-247.

[4] 邵宗澤，喻子牛.蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白作用的分子機制研究進展[J].生物工程進展，2001（6）：38-43.

[5] 韓蘭芝，吳孔明，彭于發(fā)，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻生態(tài)安全性研究進展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2006，12（3）：431-436.

[6] James C. 2009年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢——第一個十四年 1996-2009 [J].中國生物工程雜志，2010， 30 （2）： 1-22.

[7] 蔚霞. 轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸軒還田對水稻土反硝化作用和微生物多樣性的影響[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[8] 韓秋青，王愛玲，韓風(fēng)杰. 不同采血方法進行血常規(guī)檢驗在臨床應(yīng)用中的研究[J]. 當代醫(yī)學(xué)，2010，16（26）：85-86.

[9] 田輝， 樊柏林， 劉瑤，等. SPF級Wistar大鼠血液學(xué)及血生化指標正常值范圍探討[J]. 實驗動物科學(xué)，2007，24（2）：1-4.

[10]劉旭娟. 新型錐板式血液粘度測試儀控制系統(tǒng)設(shè)計[D].重慶：重慶大學(xué)，2009.