雌激素對去卵巢大鼠抑郁樣行為及杏仁核NGF表達的影響

蘇曉云，李文青，馮春梅，賀繼平，崔建梅

（1.山西醫(yī)科大學汾陽學院護理學系，山西 汾陽 032200；2.濟寧市榮復軍人醫(yī)院精神科，山東 濟寧 272000；3.四川省廣安市精神衛(wèi)生中心精神科，四川 廣安 638000；4.山西醫(yī)科大學汾陽學院解剖教研室，山西 汾陽 032200；5.中北大學體育學院運動醫(yī)學教研室，太原 030051）

雌激素對去卵巢大鼠抑郁樣行為及杏仁核NGF表達的影響

蘇曉云1，李文青2，馮春梅3，賀繼平4，崔建梅5

（1.山西醫(yī)科大學汾陽學院護理學系，山西 汾陽 032200；2.濟寧市榮復軍人醫(yī)院精神科，山東 濟寧 272000；3.四川省廣安市精神衛(wèi)生中心精神科，四川 廣安 638000；4.山西醫(yī)科大學汾陽學院解剖教研室，山西 汾陽 032200；5.中北大學體育學院運動醫(yī)學教研室，太原 030051）

目的通過觀察雌二醇治療對雌激素剝奪大鼠的抑郁樣行為及杏仁核神經(jīng)生長因子（NGF）含量的變化，探討雌二醇治療抑郁癥的作用靶點及作用機制。方法健康成年雌性SD大鼠隨機分為假手術組（SHAM組，n=10）、卵巢切除組（OVX組，n=10）及去卵巢雌二醇治療組（OVX+E組，n=10）3組。雌二醇治療8周后通過懸尾及糖水偏愛實驗觀察雌二醇對雌激素剝奪大鼠行為學的影響；隨后用免疫組織化學方法測量和分析杏仁核NGF神經(jīng)元的數(shù)量及面積。結果與SHAM組大鼠比較，OVX組大鼠糖水偏愛實驗中糖水偏愛率顯著下降（P＜0.01）、懸尾實驗中不動時間延長（P＜0.01），血清雌二醇水平及杏仁核NGF表達均顯著下降（P均＜0.01）；8周雌二醇治療改善了去卵巢大鼠的抑郁樣行為，與OVX組大鼠比較，血清雌激素水平及杏仁核NGF表達水平均顯著增加（P均＜0.01）。結論雌二醇治療改善了去卵巢大鼠的抑郁樣行為，可能與雌二醇增加去卵巢大鼠的血清雌激素水平及增強杏仁核NGF的表達有關。

雌二醇；神經(jīng)生長因子；杏仁核；抑郁

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抑郁癥是一種由多種病因引起的精神障礙性疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的特點。雌二醇主要由卵巢分泌，活性最強，它不僅調(diào)節(jié)機體的生殖活動，還參與情緒反應和神經(jīng)保護等諸多生理功能，與抑郁癥等精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關［1］。流行病學研究［2］表明，圍絕經(jīng)期即更年期女性由于雌激素水平波動對外界刺激的調(diào)節(jié)能力下降，更容易患與應激有關的精神疾病，如抑郁癥和創(chuàng)傷后應激障礙，患病率是同齡男性的2～3倍，并且病程更長、復發(fā)率更高。

杏仁核是葉邊緣結構對情緒刺激的處理至關重要的大腦區(qū)域，與情緒記憶的調(diào)節(jié)及情感行為的形成有關［3］。且研究［4］表明，杏仁核是雌激素作用的靶點之一，而且在某種程度上與卵巢摘除引起的抑郁樣行為有關。神經(jīng)生長因子（nerve growth fac?tor，NGF）是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在邊緣結構海馬及杏仁核表達較多，與情緒及認知功能有關，在神經(jīng)細胞生存、神經(jīng)可塑性及學習記憶方面起重要的調(diào)節(jié)作用。最近研究表明，雌激素可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子的NGF表達產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)作用，從而產(chǎn)生抗抑郁作用，因此，去卵巢導致的類抑郁樣行為可能是通過調(diào)節(jié)大腦特定區(qū)域NGF的表達實現(xiàn)的。

本研究采用雙側卵巢摘除術建立大鼠圍絕經(jīng)期抑郁模型，觀察雌激素對圍絕經(jīng)期抑郁模型大鼠行為學的影響，測試杏仁核NGF表達的變化，探討雌二醇改善圍絕經(jīng)期抑郁模型大鼠抑郁樣行為的可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

雌性健康成年（3月齡）SD大鼠30只，體質(zhì)量220～250 g，均購于山西醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心（動物許可證號SCXK?2009?0001）。室溫（23±1）℃，濕度55%±10%，光暗周期為（12 h照光/12 h黑暗），大鼠自由攝食、飲水。適應環(huán)境1周后，將30只大鼠隨機分為：假手術（sham operation，SHAM）組、卵巢切除（ovariectomized，OVX）組、去卵巢雌二醇（ovari?ectomized rats treated with estradiol，OVX+E）組3組。OVX+E組大鼠每天上午9時至10時腹腔注射苯甲酸雌二醇（1 mg/mL），0.1 mL/只，連續(xù)8周。

1.2卵巢切除模型建立及檢驗

手術操作如HEYDARPOUR等［5］所述，腹腔注射50 mg/kg烏來糖麻醉大鼠，剃毛暴露皮膚進行雙側卵巢切除術，在鼠腰椎處作1 cm長的縱形切口，分離皮下，結扎輸卵管及支配卵巢的血管，剪除兩側卵巢，逐層縫合肌肉和皮膚，術后連續(xù)3 d肌注20萬U青霉素。術后1周做大鼠陰道涂片檢測，造模成功的標志為連續(xù)5 d陰道監(jiān)測未見動情周期。SHAM組手術操作步驟與OVX組相同，只切除腹腔內(nèi)一小塊脂肪組織，卵巢不切除。

1.3行為學測試

1.3.1懸尾實驗（tail suspension test，TST）：雌二醇治療8周后所有大鼠進行行為學測試。按LU等［6］描述的方法，大鼠尾部被膠帶黏在距離地面60 cm的制鐵架臺上，用上方的攝像頭記錄大鼠6 min的懸尾活動情況，觀察者通過回放錄像記錄大鼠最后4 min懸尾不動時間。

1.3.2糖水消耗實驗：參照WALF等［7］描述的方法，大鼠單籠喂養(yǎng)，每籠同時放置2個水瓶。第1天，2個水瓶均裝1%的蔗糖水；第2天，1瓶裝純水，1瓶裝1%的蔗糖水，禁食禁水23 h后給予大鼠純水及1%蔗糖水各1瓶，測量大鼠1 h內(nèi)飲用純水及蔗糖水的重量。糖水偏愛率（%）=［飲用糖水量/（糖水量+純水量）］×100，該指標降低反映大鼠的快感體驗能力下降。

1.4血清雌二醇水平測試

行為學測試結束后，所有大鼠經(jīng)心臟取血2 mL，4℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清收集在EP管中，-20℃保存。采用放射免疫分析法按雌二醇測定試劑盒操作方法測試大鼠血清雌二醇水平。

1.5杏仁體NGF石蠟切片制備

大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉固定，冷生理鹽水300 mL快速經(jīng)左心室主動脈灌入、多聚甲醛150 mL緩慢灌注，至大鼠頸部僵硬，肝臟變白后用鑷子取腦，放入多聚甲醛中固定4～6 h，石蠟包埋后腦組織冠狀位切片（片厚5 μm），用于NGF免疫組化檢測。

1.6免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)乙醇常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫溶液室溫孵育30 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，切片上滴加NGF一抗單克隆抗體（1∶100），4℃孵育24～48 h，0.1M PBS液洗5 min×3次，加入生物素化山羊抗小鼠lgG（博士德生物公司），室溫孵育30 min，之后按DAB顯色試劑盒進行顯色，鏡下觀察，蘇木素復染，乙醇梯度脫水、二甲苯透明2次，自來水充分漂洗，干燥后中性樹脂封片。

1.7杏仁核NGF圖像分析

用Olympus BX50型顯微鏡攝像，采用圖像分析系統(tǒng)對拍攝圖片進行圖像分析。每組隨機抽取10張切片，分別測量杏仁核NGF 400倍陽性細胞數(shù)及面積。

1.8統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1雌激素對去卵巢大鼠血清雌激素水平的影響

與SHAM組［（25.78±3.56）pg/mL］比較，OVX組大鼠血清雌二醇水平［（8.76±1.0）pg/mL］顯著下降（P＜0.01），下降幅度為66%，去卵巢大鼠經(jīng)過雌激素8周治療，OVX+E組大鼠雌激素水平［（26.84± 4.45）pg/mL］顯著增加（P＜0.01），平均水平稍高于SHAM組，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2雌二醇對去卵巢大鼠抑郁樣行為的影響

糖水偏愛實驗用于反映抑郁癥核心癥狀快感缺失的實驗。與SHAM組（84.65%±9.63%）比較，OVX組大鼠糖水消耗百分比（59.78%±7.91%）顯著降低（P＜0.01），下降幅度為29.38%；給予去卵巢大鼠雌激素替代治療8周能夠明顯逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象（P＜0.01），OVX+E組大鼠糖水消耗百分比與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。這一結果提示雌激素治療可引起去卵巢大鼠快感增強。見圖1。

圖1　大鼠糖水偏愛實驗結果Fig.1　Results of sucrose preference test in rats

懸尾實驗用于反映動物的絕望行為。與SHAM組［（98.88±12.78）s］比較，OVX組大鼠懸尾不動時間［（155.34±23.65）s］顯著延長（P＜0.01），延長幅度為29.38%；OVX組大鼠給予雌激素治療后懸尾不動時間［（92.56±9.89）s］顯著縮短（P＜0.01），縮短時間下降幅度為40.41%；且OVX+E組大鼠懸尾不動時間與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖2。

圖1　大鼠懸尾實驗結果Fig.1　Results of tail suspension test in various group rats

2.3雌二醇對去卵巢大鼠杏仁核NGF表達的影響光鏡觀察SHAM組、OVX組及OVX+E組3組大鼠杏仁核NGF的免疫陽性反應情況，與SHAM組比較，OVX組大鼠杏仁核NGF著色稍淡，陽性細胞數(shù)目及面積均顯著減少（P均＜0.01），下降幅度為27.63%及27.72%；經(jīng)過8周雌二醇治療，與OVX組大鼠比較，OVX+E組大鼠杏仁核NGF著色較深，陽性細胞數(shù)目及面積均顯著增多（P均＜0.01），增加幅度分別為65.03%及67.05%；并且與SHAM組比較，OVX+E組大鼠杏仁核NGF顯著增強，細胞個數(shù)及面積均顯著增多（P均＜0.05）。見表1，圖3、4。

3　討論

多數(shù)學者［8］認為，圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)期女性由于雌激素水平的下降增加了患抑郁癥的敏感性。卵巢是合成雌激素的最主要器官，卵巢切除之后，血液中雌激素含量將明顯降低，本研究已經(jīng)證實，去卵巢大鼠雌激素水平顯著下降。此模型可以很好地模擬絕經(jīng)期女性雌激素含量低下，并且去卵巢大鼠糖水偏愛率減少，懸尾實驗中大鼠不動時間延長，說明卵巢摘除大鼠出現(xiàn)了興趣喪失、快感缺乏及行為絕望等抑郁行為的核心癥狀。以前學者［9］通過強迫游泳行為學測試發(fā)現(xiàn)，雌二醇治療可以減少強迫游泳實驗中大鼠不動時間、增強去卵巢大鼠游泳時間。BASTOSA等［10］發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠海馬及杏仁核注射雌二醇會導致大鼠焦慮和抑郁行為的減弱。本研究得到了相同結果，去卵巢大鼠給予雌二醇替代治療8周雌激素水平恢復到正常，與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異，說明雌二醇治療能夠改善去卵巢大鼠的抑郁樣行為，增強快感、改善絕望及無助行為，結果說明，雌激素具有抗抑郁作用。

杏仁核是神經(jīng)反應的關鍵組成部分，患有重性精神疾病的患者出現(xiàn)杏仁核結構和功能的異常［11］。核磁共振研究［12］發(fā)現(xiàn)，抑郁患者的杏仁核容量增大。NGF在保持突觸可塑性及神經(jīng)元的結構和完整方面起著重要作用，對應激引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)退化疾病方面起重要調(diào)節(jié)作用［13］。大量研究［14］證實，多種應激可以調(diào)節(jié)大腦NGF的表達，并且應激對NGF的影響取決于應激的種類及持續(xù)時間。DWIVEDI等［15］研究發(fā)現(xiàn)重性抑郁癥自殺者額葉皮層的NGF蛋白水平顯著下降，而且動物實驗［16］證實暴露在急、慢性應激的大鼠NGF水平均顯著下降。BJORLING等［17］研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除可引起NGF蛋白含量明顯下降，短期雌激素或孕激素治療會增加大鼠NGF mRNA含量，使其含量恢復到正常大鼠水平。當前研究結果顯示，大鼠卵巢切除作為一種應激刺激源會引起杏仁核NGF表達減少，提示杏仁核NGF在雌性大鼠雌激素剝奪致抑郁樣行為中可能發(fā)揮了重要作用。OVERSTREET等［18］證實給予抑郁大鼠一定劑量的NGF可產(chǎn)生抗抑郁作用，強迫游泳實驗中不動時間縮短，掙扎時間延長。因此，可以推測雌激素剝奪大鼠糖水偏愛中糖水偏愛百分比下降、懸尾實驗中不動時間延長等無助、絕望及快感下降等抑郁行為與杏仁核NGF的表達減少有關。臨床研究［19］認為，雌二醇替代療法可有效恢復自然絕經(jīng)或手術后卵巢切除患者的情緒障礙，STRADA?CAMARENA等［20］證實雌激素具有抗抑郁作用，并且注射雌激素可以逆轉(zhuǎn)抑郁模型的無助行為及提高海馬可塑性［21］。研究［22］認為，雌激素可以通過調(diào)節(jié)NGF水平及其受體發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用。杏仁核是含雌激素受體最多的大腦區(qū)域之一，因此可以推測，雌激素替代治療可以通過提高雌激素受體的表達介導NGF的表達，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用，維持大腦的正常結構，改善長期雌激素剝奪大鼠的抑郁樣行為，具體機制需進一步研究。

表1　各組大鼠杏仁核NGF表達結果（x±s，n=10）Tab.1　Results of amygdala NGF expression in various groups of rats（x±s，n=10）

圖3　杏仁核冠狀定位 ×40Fig.3　Amygdaloid nucleus in stereotaxic coordinates×40

圖4 杏仁核NGF表達 ×400Fig.4　Amygdaloid nucleus NGF expression×400

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（編輯于溪）

Effects of Estradiol on Depressive Behavior and Amygdaloid NGF Expression in Ovariectomized Rats

SU Xiaoyun1，LI Wenqing2，F(xiàn)ENG Chunmei3，HE Jiping1，CUI Jianmei4
（1.Department of Nursing Humanities Teaching and Research Section，F(xiàn)enyang College of Shanxi Medical University，F(xiàn)enyang 032200，China；2.Department of Psy?chiatry，Rongfu Military Hospital of Jining，Jining 272000，China；3.Department of Psychiatry，Mental Health Center of Guang’an in Sichuan Province，Guang’an 638000，China；4.Department of Anatomy Teaching and Research Section，F(xiàn)enyang College of Shanxi Medical University，F(xiàn)enyang 032200，China；5.Department of Physical Education，North University of China，Taiyuan 030051，China）

ObjectiveTo observe the changes of the depressive behavior and amygdaloid nucleus nerve growth factor（NGF）expression in estro?gen?deprived female rats and explore the possible mechanism and targets of estradiol in depression treatment.MethodsA total of 30 adult SD fe?male rats were randomly assigned to 3 groups：sham operation group（SHAM，n=10）；ovariectomized group（OVX，n=10）and ovariectomized rats treated with estradiol group（OVX+E，n=10）.The behavior changes were observed by tail suspension test（TST）and sucrose preference test（SPT）after 8?week estradiol treatment.Subsequently，immunohistochemical staining detect NGF expression in amygdaloid nucleus.Results Compared with the SHAM group rats，sucrose preference ratio significantly decreased in SPT（P＜0.01），immobile time prolonged in TST（P＜0.01），serum estradiol level and amygdaloid NGF expression significantly decreased（allP＜0.01）.8?week estradiol treatment ameliorated depres?sion?like behavior and increased serum E2 level and NGF expression in amygdaloid nucleus in OVX+E group rats when compared with the OVX group（allP＜0.01）.ConclusionEstradiol treatment can improve the depressive behavior of ovariectomized rats，which may be related to the in?crease of serum estradiol level and the expression of NGF in amygdaloid nucleus.

estradiol；nerve growth factor；amygdaloid nucleus；depression

R749

A

0258-4646（2016）12-1119-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.014

蘇曉云（1982-），女，講師，碩士.

賀繼平，E-mail：1666485669@qq.com

2016-04-05

網(wǎng)絡出版時間：