CD88在肝細胞癌中的表達及其與預后的關系

蘇子劍，柯少迎，費洪江

（福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院 腫瘤外科，福建 泉州 362000）

·經驗交流·

CD88在肝細胞癌中的表達及其與預后的關系

蘇子劍，柯少迎，費洪江

（福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院 腫瘤外科，福建 泉州 362000）

目的 檢測補體5片段受體（complement component 5a receptor）CD88在肝細胞癌組織中的表達情況，探討其與肝細胞癌患者臨床病理參數(shù)的關系及其對預后的臨床意義。方法 應用免疫組織化學方法檢測171例肝細胞癌組織和癌旁組織中CD88的表達情況，并分析CD88與肝細胞癌臨床病理特征及預后的關系。結果 CD88在肝細胞癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織（Z=-11.540，P＜0.001）。年齡≥50歲（x2= 10.77，P=0.005）、TNM分期I I～I I I（x2=17.31，P=0.002）、腫瘤直徑≥5 cm（x2=17.65，P＜0.001），腫瘤數(shù)目≥2個（x2=14.68，P＜0.001）、腫瘤侵犯血管（x2=11.05，P＜0.001）者肝細胞癌組織中CD88表達明顯偏高（P＜0.05），但患者的性別、術前AFP水平、HbsAg狀態(tài)、有無腹水和術前肝功Child-Pugh分級與CD88表達無明顯相關（P均＞0.05）。單因素分析顯示，術前TNM分期、術前肝功能分級、血管浸潤、CD88表達、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目與肝細胞癌患者總生存期相關（P＜0.05），術前肝功能分級、血管浸潤、CD88表達、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目與肝細胞癌患者無進展生存時間相關（P＜0.05）。COX風險模型提示，CD88為影響肝細胞癌總體生存時間和無進展生存時間的獨立危險因素。結論 CD88可能參與肝細胞癌的惡性進展，其高表達可能提示肝細胞癌患者預后不良。

癌，肝細胞；補體5片段受體CD88；預后

越來越多的證據表明，全身炎癥反應與腫瘤進展，侵襲以及轉移有關，其機制主要與炎性細胞、細胞因子、趨化因子在腫瘤微環(huán)境的浸潤有關。補體系統(tǒng)在炎癥過程中自然而然成為主要參與者。補體系統(tǒng)既可對腫瘤的生長提供保護機制，亦有抑制腫瘤生長的作用。研究表明CD88可提供腫瘤生長所需的抑制性免疫微環(huán)境。CD88通過與強炎性介質C5a的結合在急性肺損傷、類風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、腎小球腎炎、膿毒血癥等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。最近，有研究發(fā)現(xiàn)對于CD88在胃癌[1]、胰腺癌[2]、膽管癌[3]、非小細胞肺癌[4]中表達增加，并與肝內膽管細胞癌血管浸潤直接相關，是非小細胞肺癌的獨立預后指標。動物模型研究發(fā)現(xiàn)CD88的過度激活與犬乳腺癌[5]、子宮頸癌[6]發(fā)病相關。但在肝細胞癌中的表達國內研究尚少，本研究擬通過免疫組織化學檢測CD88在肝細胞癌組織中表達的情況，探討其與臨床病理參數(shù)的關系及對肝細胞癌預后的臨床意義。

1 資料和方法

1.1病例資料

選擇1996年6月至2007年9月在我院腫瘤外科行肝部分切除術且隨訪資料完整的171例原發(fā)性肝細胞癌患者，所有的患者均由同一組外科醫(yī)生進行手術治療，術后病理學檢查均證實為原發(fā)性肝細胞癌。肝癌組織取材于未壞死腫瘤組織，癌旁組織取材于距離腫瘤邊緣2 cm以上肝組織。剔除標準：術前伴有遠處轉移的病例；研究對象術前進行全身化療、經導管肝動脈栓塞化療（TACE）、局部消融等治療者。所有患者隨訪至2012年9月1日止。生存時間按月計算，以手術日期起算至死亡日期或末次隨訪日期。

本組171例患者中男157例，女14例；年齡25～75歲，中位年齡54歲，平均年齡（52.7±12.67）歲；術前CRP水平、HbsAg狀態(tài)、AFP水平、Child-Pugh分級、腹水情況、腫瘤數(shù)目、合并血管浸潤者情況、有無血管浸潤情況詳見表1。

1.2免疫組化實驗

臨床肝癌及癌旁組織經常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化。將切片置于檸檬酸抗原修復液中高壓1.5 min，自然冷卻，PBS沖洗；滴加50 μL即鼠抗人CD88單克隆抗體（1:200，Abcam），室溫孵育1 h，PBS沖洗；滴加50 μL即用型MaxVision3檢測二抗（福州邁新），室溫孵育30 min，PBS沖洗；滴加50 μL DAB顯色液（福州邁新），室溫孵育5 min，自來水沖洗；蘇木素復染、PBS返藍、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢。

1.3免疫組化結果判定

隨機采集10個具有代表意義的顯微鏡視野的腫瘤細胞計數(shù)并取平均數(shù)值，計算陽性細胞百分比。CD88陽性染色判斷標準：胞漿或胞膜有棕黃色顆粒沉著者為陽性染色。依陽性細胞百分率判定陽性強度。陽性細胞數(shù)≤10％為“+”，10％～50％為“++”，≥50％為“+++”。

1.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。率的比較采用x2檢驗或者Wilcoxon檢驗。Kaplan-Meier法統(tǒng)計影響肝癌切除術后術后總生存時間和無進展生存時間的因素，Log-Rank檢驗比較各組的累積生存率的差異，多因素分析采用Cox比例風險模型，檢驗水準均為α=0.05，即P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1CD88在肝細胞癌組織和癌旁組織中的表達

免疫組織化學染色顯示，肝細胞癌組織中CD88表達明顯，CD88主要在細胞膜上表達（褐色），部分細胞細胞漿亦見CD88表達（圖1）；癌旁組織CD88呈陰性表達，細胞核未見染色（圖2）。19.8％（34/171）腫瘤組織呈低度表達，37.4％（64/171）腫瘤組織呈中等程度表達，42.6％（73/171）的腫瘤組織呈強陽性表達。癌組織與癌旁組織CD88表達差異具有統(tǒng)計學差異（Z=-11.540，P＜0.001）。

圖1　CD88在肝細胞癌組織中的表達（Elivision，×400）

圖2　C D88在癌旁組織中的表達（Elivision，×400）

2.2CD88表達與臨床病理參數(shù)的關系

研究發(fā)現(xiàn)，年齡≥50歲、TNM分期I I～I I I、腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤數(shù)目≥2個、腫瘤侵犯血管者，肝癌組織中CD88表達明顯高于對應組（P＜0.05），但患者的性別、術前AFP水平、HbsAg狀態(tài)、有無腹水和術前肝功Child-Pugh分級與肝癌組織中CD88表達無明顯相關（P均＞0.05）。見表1。

表1　肝癌組織中CD88的表達與患者臨床病理參數(shù)的關系

2.3肝細胞癌患者總生存時間影響因素分析

單因素分析顯示，術前TNM分期、術前肝功能分級、血管浸潤、CD88表達、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目與肝細胞癌患者總生存期相關，TNM分期更晚、腫瘤浸潤血管、CD88表達強陽性、腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤數(shù)目≥2個的患者預后更差（見表2）。但患者的性別（x2= 0.202，P=0.653）、年齡（x2=0.479，P=0.489）、術前有無腹水（x2=0.049，P=0.825）、術前AFP（x2=0.032，P=0.857）、HbsAg狀態(tài)（x2=0.134，P=0.714）與總生存期無關。

將單因素分析有統(tǒng)計學意義的相關因素進行COX風險模型分析顯示，CD88表達為肝癌總體生存時間預后的獨立危險因素（見表2和圖3）。

表2　影響肝細胞癌患者總生存期的單因素和多因素分析

圖3　CD88表達與肝細胞癌患者總生存時間的關系

2.4肝細胞癌患者無進展生存時間影響因素分析

單因素分析顯示，術前肝功能分級、血管浸潤、CD88表達、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目與肝細胞癌患者無進展生存時間相關，術前肝功能差、腫瘤浸潤血管、CD88強陽性、腫瘤直徑大于≥5 cm、腫瘤數(shù)目≥2個的患者更容易出現(xiàn)腫瘤進展（見表3）。而性別（x2= 1.750，P=0.186）、年齡（x2=0.000，P=0.987）、術前有無腹水（x2=0.005，P=0.944）、術前AFP水平（x2= 0.002，P=0.961）、術前TNM分期（x2=5.876，P=0.053）、HbsAg狀態(tài)（x2=0.148，P=0.701）與患者無進展生存時間無關。見表3。

將單因素分析有意義的相關因COX風險模型分析顯示，CD88表達為影響肝細胞癌無進展生存時間預后的獨立危險因素（見圖4）。

表3　影響肝細胞癌患者無進展生存時間的單因素和多因素分析

圖4　CD88與肝細胞癌患者無進展生存時間的關系

3 討論

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，居腫瘤相關死亡第3位。肝癌在我國高發(fā)，目前，我國發(fā)病人數(shù)約占全球的55％；腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，位居第二。先天性的遺傳改變和后天的高危因子例如的感染、肝硬化、酒精性肝病及黃曲霉素的污染等都是導致肝細胞癌高發(fā)的危險因素。通過全基因組表達微陣列分析已證實很多導致失控性生長和異常生存信號的重要通路。但是，還沒有有意義的基因標記或預后指標進入到臨床實踐，因此需進一步研究和尋找肝細胞癌新的診斷及預后標志物。

雖然研究發(fā)現(xiàn)CD88在多種腫瘤中表達增高，但對于CD88促進腫瘤侵襲轉移的機制，目前尚不清楚。Nabha等[7]通過Transwell小室發(fā)現(xiàn)C5a能明顯增強癌細胞的侵襲能力，MMP抑制劑GM6001能明顯抑制癌細胞的增殖和侵襲能力。有研究表明CD88通過促進基質金屬蛋白酶的分泌促進腫瘤的侵襲，提示影響基質金屬蛋白酶分泌的多種信號通路可能與CD88的信號傳遞相關。另一方面，CD88可能通過影響T細胞而影響腫瘤免疫[3]。Dunkelberger等發(fā)現(xiàn)細胞內CD88可以發(fā)出信號促進T細胞的活化和分化，對T細胞免疫應答產生影響[8]。抑制小鼠表達C5a可以影響腫瘤周邊CD68+巨噬細胞[2]。C5a還通過CD88募集髓源性抑制細胞來抑制CD8+T細胞抗腫瘤反應，從而促進腫瘤免疫逃避[4]。Markiewski等證實C5a通過CD88抑制T細胞的抗腫瘤反應，促進腫瘤生長[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)對于CD88在肝細胞癌、肝內膽管癌等多種腫瘤中表達增加[3]，并與肝內膽管細胞癌血管浸潤直接相關，是肝細胞癌的獨立預后指標。本研究應用免疫組織化學發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中CD88表達明顯比癌旁肝組織高，表明CD88表達可能與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展和惡性行為存在關系，CD88表達水平在年齡大于50歲、TNM分期I I期以上、腫瘤直徑大于5 cm，腫瘤數(shù)目多于1個，腫瘤侵犯血管者癌組織中表達較高，進一步說明了CD88表達與腫瘤細胞分化、增殖和侵襲轉移存在密切關系。通過Cox模型分析發(fā)現(xiàn)CD88是影響原發(fā)性肝癌總生存時間和無進展生存時間的獨立因素，說明CD88不僅在原發(fā)性肝癌表達增加，而且術后可以通過檢測CD88在腫瘤中的表達水平預測預后，并可能可以指導治療。

[1] 柯少迎, 蘇子劍, 葉曉楠, 等. CD88在胃癌中的表達及其對細胞侵襲能力的影響 [J]. 中國腫瘤外科雜志, 2016, 8(3): 169-172.

[2] CONTRACTOR T, KOBAYASHI S, Da SILVA E, et al. Sexual dimorphism of liver metastasis by murine pancreatic neuroendocrine tumors is affected by expression of complement C5 [J]. Oncotarget, 2016, 7(21): 30585-30596.

[3] NITTA H, WADA Y, KAWANO Y, et al. Enhancement of human cancer cell motility and invasiveness by anaphylatoxin C5a via aberrantly expressed C5a-receptor (CD88) [J]. Clin Cancer Res. 2013, 19(8): 2004-2013.

[4] GU J, DING J Y, LU C L, et al. Overexpression of CD88 predicts poor prognosis in non-small-cell lung cancer [J]. Lung Cancer, 2013, 81(2): 259-265.

[5] HEZMEE M N, KYAW-TANNER M, LEE J Y, et al. Increased expression of C5a receptor (CD88) mRNA in canine mammary tumors [J]. Vet Immunol Immunopathol, 2011, 139 (1): 50-56.

[6] MACIEJ M, MARKIEWSKI, ROBERT A. Modulation of the anti-tumor immune response by complement [J]. Nat Immunol, 2008, 9(11): 1225-1235.

[7] NABHA S M, DOS SANTOS E B, YAMAMOTO H A, et al. Bone marrow stromal cells enhance prostate cancer cell invasion through type I collagen in an MMP-12-dependent manner [J]. Int J Cancer 2008, 122(11): 2482-2490.

[8] DUNKELBERGER J, ZHOU L, MIWA T, et al. C5aR expression in a novel GFP reporter gene knockin mouse: implications for the mechanism of action of C5aR signaling in T cell immunity [J]. J Immunol, 2012, 188(8): 4032-4042.

[9] MARKIEWSKI M M, LAMBRIS J D. et al. Unwelcome complement [J]. Cancer Res, 2009, 69(16): 6367-6370.

（本文編輯：張海燕，魯翠濤）

Expression of CD88 in hepatocellular carcinoma and its significance on prognosis

SU Zi-jian, KE Shao-ying, FEI Hong-jiang. Department of Oncosurgery, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Quanzhou, FuJian 362000, China

Objective To investigate the expression of complement component 5a receptor CD88 in hepatocellular carcinoma (HCC) tissue and to explore the correlation between expression of CD88 and clincopathological characteristics, to evaluate the prognosis of CD88 in HCC patients. Methods Expression of CD88 was detected by immunohistochemistry in 171 HCC tissues and corresponding adjacent-cancer tissues. Correlation between CD88 expression and clincopathological characteristics and prognosis were analyzed. Results The expression of CD88 in HCC tissues was significantly higher than that in the adjacent-cancer tissues (Z=-11.540, P＜0.001). The expression of CD88 in HCC tissues was higher in HCC patients with age over ≥50 years (x2=10.77, P=0.005), TNM stage II～III (x2=17.31, P=0.002), tumor size≥5 cm (x2=17.65, P＜0.001), tumor number≥2 (x2=14.68, P＜0.001), and vascular invasion (x2=11.05, P＜0.001). There was no significant correlation between CD88 expression and patients’ gender ratio, preoperative AFP level, status of HbsAg, with ascites or not and preoperative Child-Pugh classification (all P＞0.05). In univariate analysis, preoperative TNM stage, Child-Pugh classification, vascular invasion, CD88 expression, tumor size and tumor number were significantly associated with overall survival of HCC patients (P＜0.05). Preoperative Child-Pugh classification, vascular invasion, CD88 expression, tumor size and tumor number were significantly associated with disease-free survival of HCC patients (P＜0.05). In multivariate analysis, the expression of CD88 was independent predictor for overall survival and disease-free survival of HCC patients. Conclusion CD88 may be involved in the malignant progression of HCC, and the over-expression of CD88 maybe suggestt the poor prognosis in HCC patients.

hepatocellular carcinoma; complement component 5a receptor CD88; prognosis

R735.7

A

10.11952/j.issn.1007-1954.2016.06.010

2016-03-18

福建省自然科學基金項目（2014J10435）；泉州市科技計劃項目（2013Z58）。

蘇子劍（1978-），男，福建南安人，主治醫(yī)師，碩士。