竹燕窩的分子鑒定及金屬元素的含量分析

□ 潘潔莉　高麗娜　盛振華　李美芽　浙江中醫(yī)藥大學(xué)

竹燕窩的分子鑒定及金屬元素的含量分析

□ 潘潔莉高麗娜盛振華李美芽浙江中醫(yī)藥大學(xué)

竹燕窩，又名竹菌，有抗菌消炎、潤肺滋陰、美容養(yǎng)血等功效，是珍稀的真菌類微生物。主產(chǎn)自四川和云南，在浙江少見。因其形與味如同燕窩，口感潤滑清香，營養(yǎng)價值甚高，被譽為植物燕窩，曾歷次受央視等媒體的關(guān)注。研究表明，竹燕窩多糖具有一定的抗氧化活性，其醇提物對人食道癌、乳腺癌、白血病和肝癌均具有較好的預(yù)防功能。

作為一種絕美食品，食用安全性十分重要。食品中的金屬元素含量是當前人們關(guān)心的重點，重金屬會通過食物鏈進入人體會帶來潛在的健康危機。因此，對食品中金屬元素含量分析十分必要。目前，竹燕窩中金屬元素含量的研究還未見報道，本研究對浙江杭州的竹燕窩進行分子鑒定后，采用ICP-AES測定其中9種金屬元素的含量，了解竹燕窩的生長地域性和環(huán)境特殊性，為竹燕窩作為食品保健品提供理論參考。

材料與方法

材料

電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，Therm o Scientific公司；Coolsafe冷凍干燥儀，丹麥Labogene公司；PCR儀，德國Eppendorf公司。

砷、鈣、鎘、鐵、銅、汞、錳、鉛和鋅9種重金屬單元素，均購自環(huán)保部標準樣品研究所；硝酸，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氬氣（含量大于99.99%），購自上海五鋼氣體有限責(zé)任公司；竹燕窩，采自浙江省杭州市。

方法

1 竹燕窩顯微觀察

挑取少量竹燕窩子實體，壓片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察子實體和孢子形態(tài)。

2 基因組DN A提取

采用CTAB法提取子實體基因組DN A，純度合格的DN A作為PCR擴增的模板。

3 ITS序列的擴增和分析

用真菌rRN A基因的ITS區(qū)擴增通用引物18SF（5’-TCCG TAG G TG AACCTG CG G-3’）和28SR（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行PCR，擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。測得的序列采用Blast比對分析，獲得指標靠前的相似序列，通過M EGA軟件以最大似然法構(gòu)建N J系統(tǒng)發(fā)育樹。樹形圖上的百分數(shù)表示比較菌株之間的相似度。

4 金屬元素含量分析

（1）樣品處理。取新鮮采取的竹燕窩，超純水清凈，-80 ℃冷凍過夜，于冷凍干燥儀中凍成干粉。準確稱取三份樣品各約0.5 g（精確到0.0001 g）置于微波消解罐中，加入10 m L硝酸靜置過夜，然后裝好外罐在微波消解儀中進行消解，冷卻后轉(zhuǎn)移置50 m L容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液備用。另取10 m L消化液，同法制作空白溶液。

（2）標準曲線繪制。分別吸取一定量的各元素標準品，用30%硝酸溶液配置4種不同濃度的混合溶液。依次在相應(yīng)波長下測定各個不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液的吸光度，每一質(zhì)量濃度測定3次，以吸光度Y為縱坐標，相應(yīng)元素標準溶液質(zhì)量濃度X（μ g/m L）為橫坐標，繪制標準曲線并確定其相關(guān)系數(shù)及線性范圍。

（3）樣品微量元素含量測定。設(shè)定儀器入射功率：1150 W；輔助流速：0.5 L/m in；霧化器泵流量：50 r/m in；分析泵速：50 r/m in；最大積分時間：30 s；沖洗3次，每次30 s。根據(jù)各元素含量的不同，選擇靈敏度較高，其他元素干擾最小的譜線作為分析線。按上述設(shè)定的儀器操作條件，測定供試品溶液的吸光度，由各元素的回歸方程，計算相應(yīng)的濃度，扣除試劑的空白值，得出樣品中各元素的含量。

結(jié)果與討論

子實體形態(tài)特征

從圖1中可看出，竹燕窩子實體叢生，呈淡黃色珊瑚狀（圖1-A）。分支很多，分支明顯，尖端黑色部分為分生孢子器（圖1-B/C）。將分生孢子器進行壓片后于光學(xué)顯微鏡下觀察，可見孢子為橢圓形，中間有1～2個球狀物（圖1-D）。

圖1　竹燕窩子實體以及孢子形態(tài)

分子鑒定

將測得的ITS序列用Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)其序列與Scorias spongiosa（HM 480490.1）最為接近，相似性可達99%，可推測該竹燕窩的形成菌株為Scorias spongiosa，與賀慶生分離的竹燕窩菌株為同一種菌株。在N CBI上下載與該菌株的ITS序列接近的一些菌株的序列，采用M EGA軟件以最大似然法構(gòu)建了N J進化樹，如圖2所示。可看出，浙江產(chǎn)的竹燕窩與HM 480490.1進化關(guān)系最為接近，可達87%。

圖2　竹燕窩的系統(tǒng)發(fā)育樹

國家食用菌標準參考

參考《食品安全國家標準》（GB 2762-2012）食用菌類中的限量標準，可發(fā)現(xiàn)浙江竹燕窩中的Hg、Pb、Cd、As含量均較低，符合食品安全標準。Cu、M n、Zn、Fe、Ca含量較高，F(xiàn)e、Zn、Cu、M n是人體必需的微量元素，鈣是人體必需的常量元素，這些都是對人體有益的元素。

結(jié)論

元素含量檢測

從表1可以看出，各元素的回歸方程線性關(guān)系很好，相關(guān)系數(shù)均可達到0.999以上，可用于后續(xù)樣品中元素含量的測定。

將竹燕窩樣品溶液按儀器工作條件進行檢測。測得數(shù)據(jù)代入回歸方程后扣除空白值，得到樣品中各元素的濃度，根據(jù)所稱量的重量，換算成質(zhì)量比，結(jié)果見表2。

元素平均值±誤差限H g 0 . 0 1 3 ± 0 . 0 0 1 P b 0 . 3 3 0 ± 0 . 0 3 2 C d 0 . 0 3 0 ± 0 . 0 0 4 A s 0 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 C u 7 . 8 1 6 ± 0 . 1 0 0 M n 1 0 . 8 6 0 ± 0 . 1 0 1 Z n 2 0 . 0 1 2 ± 0 . 2 5 5 C a 7 4 1 3 . 7 1 6 ± 2 6 . 2 8 F e 4 7 . 1 4 1 ± 0 . 3 3 7

本研究對浙江竹燕窩進行分子鑒定，并采用微波消解ICP-AES法測定其中的9種金屬元素的含量。所測定的竹燕窩樣品中的Hg、Pb、Cd、As的含量均符合我國食品安全國家標準GB 2762-2012。食品中污染物限量標準并未對Fe、Zn、Cu、M n的含量進行限定，因此無法判斷竹燕窩樣品中這四種元素的含量是否超標。但Fe、Zn、Cu、M n、Ca都是人體所必需的元素，在人體的生命活動過程中起著重要的作用。這些元素含量與種植環(huán)境中的土壤和水源有一定的關(guān)系，從研究結(jié)果來看，浙江竹燕窩可作為安全食品，可補充人體所必需的Ca、Fe等元素。本研究為了解竹燕窩的營養(yǎng)價值提供了理論基礎(chǔ)。

浙江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金（編號：2014ZR12），浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研基金（編號：JC201308）。

李美芽。

潘潔莉（1986-），女，碩士，助理實驗師。研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。