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    甘氨酸的抑菌作用分析

    2016-12-13 10:55:39廖夏云黃小云馮麗敏聶紅梅池明亮廣西中醫(yī)藥大學(xué)
    食品安全導(dǎo)刊 2016年33期
    關(guān)鍵詞:甘氨酸濃度效果

    □ 廖夏云 黃小云 馮麗敏 聶紅梅 池明亮 譚 強(qiáng) 廣西中醫(yī)藥大學(xué)

    甘氨酸的抑菌作用分析

    □ 廖夏云黃小云馮麗敏聶紅梅池明亮譚強(qiáng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)

    甘氨酸可作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑和調(diào)味劑應(yīng)用于食品中,還具有一定的抑菌效果。本文通過研究甘氨酸在不同的條件下對大腸桿菌(Escherichia coli,以下簡稱E.coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下簡稱Sa)的抑菌活性,確定甘氨酸對這兩種食品中常見的致病菌的最佳的抑制條件。用微量肉湯稀釋法,測定在不同的濃度、不同pH值、不同時(shí)間的條件下,甘氨酸對E.coli和Sa的抑菌率,確定最佳的抑菌條件。通過單因素實(shí)驗(yàn)研究表明甘氨酸對E.coli的最佳抑菌條件:濃度為2.0%(g/mL),pH為7,時(shí)間為20 h,抑菌率為100%。甘氨酸對Sa的最佳抑菌條件:濃度為2.5%(g/mL),pH為5,時(shí)間為16 h,抑菌率為100%。甘氨酸對Sa和E.coli均具有良好的抑制作用,對E.coli的抑制效果更好。

    甘氨酸,抑菌,微量肉湯稀釋法

    甘氨酸(Glycine),又名氨基乙酸(C2H5N O2),在氨基酸中結(jié)構(gòu)最簡單,為人體非必需氨基酸。甘氨酸為白色單斜晶系的晶體或白色性結(jié)晶粉末,無臭、無毒、易溶于水[1],甜度為蔗糖的0.8倍。大鼠口服半數(shù)致死量LD50是7.93 g/kg[2]。

    目前,谷氨酸鈉(味精)和甘氨酸是全世界用量最大的調(diào)味品。甘氨酸因具有抗氧化作用而被添加到奶油、干酪、人造奶油中,能延長保質(zhì)期3~4倍,在火腿、臘腸、魚肉、花生醬等食品中添加1%~2%的甘氨酸能達(dá)到防臭和防腐的效果[3],甘氨酸還用于配制運(yùn)動(dòng)員的營養(yǎng)飲料及其氨基酸食品,食用添加甘氨酸的食品對人體胃液酸度的調(diào)節(jié)、肌肉活力的提高有一定作用[4-7]。

    我國允許使用的防腐劑有30多種,但安全無毒、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、抑菌廣泛并適用于各種食品的理想防腐劑仍然很少。甘氨酸來源豐富,對動(dòng)物的毒性很低,同時(shí)幾乎不對人體產(chǎn)生毒性,因此可作為一種非特異性防腐劑。石春芝 等[8]對甘氨酸的抑菌作用研究表明,3%的甘氨酸對堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌抑菌的作用非常明顯,甘氨酸與低級脂肪酸合并使用時(shí)對引起豆腐腐敗的微生物有顯著的抑菌作用。在席曉嵐 等人的研究報(bào)道中,用4-硝基苯甲醛與甘氨酸反應(yīng)合成Schiff堿,抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,該化合物對紅色毛癬菌、孢子絲菌、白色念珠菌均有不同程度的抑菌活性作用[9]。

    如何既防止食品的腐敗變質(zhì),又滿足消費(fèi)者對防腐劑安全無毒、經(jīng)濟(jì)有效的要求是目前研究的熱點(diǎn),甘氨酸既具有防腐作用,又有營養(yǎng)和改善食品風(fēng)味等作用,這樣的天然防腐劑的研究和開發(fā)利用是食品科學(xué)工業(yè)的一個(gè)新方向。本文采用微量肉湯稀釋法,探究在不同濃度、pH值、時(shí)間的條件下甘氨酸對大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(Sa)的最佳抑制條件,擴(kuò)展對甘氨酸抑菌作用的環(huán)境和條件的研究,進(jìn)一步了解甘氨酸的抑菌作用效果。

    1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

    1.1材料與儀器

    金黃色葡萄球菌CICC 10384,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供;大腸桿菌CICC 10419,購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;M ueller-Hinton Broth,北京陸橋技術(shù)有限公司;瓊脂,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甘氨酸,分析級,含量不少于99.0%,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

    752N紫外分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;JJ200電子天平,常熟市雙杰測試儀器廠;LRH-250-S恒溫培養(yǎng)箱,韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司;DHG-9503A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海柏欣儀器設(shè)備廠;VS-840K-U潔凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;YXQ-LS-50SII立式蒸汽壓力滅菌柜,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JB-3恒溫定時(shí)攪拌器,上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司;XW-80A旋渦混合器,江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;DK-98-11電子調(diào)溫萬用爐,天津市泰斯特儀器有限公司;TP8D300H移液槍,TO PSCIEN;Biotek Epoch全波長酶標(biāo)儀。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1溶液制備

    配制濃度為0.2 g/m L的甘氨酸溶液,分別用醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4、5,用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至6、7、8、9,放入冰箱保存,備用。

    1.2.2培養(yǎng)基的制備

    M HB固體培養(yǎng)基:稱取M HB培養(yǎng)基12.5 g,加入瓊脂7.5 g,蒸餾水500 m L,溶解,分裝,煮至清澈透明,121 ℃高壓滅菌15 m in,備用。

    M HB液體培養(yǎng)基:稱取M HB培養(yǎng)基12.5 g,加入蒸餾水500 m L,溶解,分裝,煮至清澈透明,121 ℃高壓滅菌15 m in,備用。

    1.3甘氨酸在不同濃度、pH值、時(shí)間下的抑菌作用

    1.3.1濃度對抑菌效果的影響

    取潔凈無菌的96孔板,8列(1~8)×12行(A~L),pH=7的甘氨酸儲(chǔ)備液和液體培養(yǎng)基、菌液。

    96孔板1~8列加入順序見表1,A~D行加入E.coli菌液,E~H行加入Sa菌液,加入完畢后,將96孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)溫度為37 ℃,14 h后取出,用酶標(biāo)儀測定O D620值,計(jì)算抑菌率。

    1.5.2pH值對抑菌效果的影響

    以1.5.1中對抑菌效果顯著的最低濃度為最佳抑菌濃度,參照表1在96孔板中加入pH值分別為5、6、7、8、9的該濃度甘氨酸儲(chǔ)備液,加入相應(yīng)的無菌水、液體培養(yǎng)基和菌液,放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后,取出,用酶標(biāo)儀測定O D620值,計(jì)算抑菌率。

    1.5.3抑菌時(shí)間對抑菌效果的影響

    將1.5.2中抑菌效果最佳的處理再放回37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2 h測定O D620值,即記錄14、16、18、20 h和22 h時(shí),在最佳抑菌濃度、最佳抑菌pH值條件下,甘氨酸的抑菌率隨時(shí)間的變化情況。

    1.5.4抑菌率計(jì)算方法

    抑菌率按照公式(1)計(jì)算:

    當(dāng)實(shí)驗(yàn)O D值大于陽性對照O D值時(shí),抑菌率記為0.0%;當(dāng)實(shí)驗(yàn)O D值小于陰性對照O D值時(shí),抑菌率記為100.0%。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

    2.1不同濃度甘氨酸的抑菌效果

    濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的甘氨酸對E.coli的抑菌率分別為0.0%、37.4%、76.1%、100.0%和100.0%,如圖1所示。由圖1可知,隨著甘氨酸濃度的增加,對E.coli的抑制作用增強(qiáng),甘氨酸濃度到達(dá)2.0%后,甘氨酸對E.coli的抑菌率達(dá)100%。甘氨酸濃度為0.5%時(shí),對E.coli沒有抑菌作用,甘氨酸屬于氨基酸,是E.coli良好的營養(yǎng)物質(zhì),此時(shí)E.coli將甘氨酸作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收;濃度為1.0%時(shí),甘氨酸開始抑制E.coli,當(dāng)濃度到2.0%時(shí),抑菌率為100.0%,抑菌效果最佳,濃度升高到2.5%,抑菌率同樣為100%,說明濃度達(dá)到2.0%后甘氨酸對E.coli都有很好的抑制作用。

    表1 甘氨酸的抑菌濃度

    圖1 pH為7的甘氨酸對E.coli的抑制作用

    測定濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的甘氨酸對Sa的抑制作用,得到抑菌率分別為0.0%、0.0%、2.6%、55.9%、100.0%、100.0%,如圖2所示。由圖2可知,隨著甘氨酸濃度的增加,對Sa的抑制作用增強(qiáng),當(dāng)甘氨酸濃度達(dá)到2.5%時(shí),甘氨酸對Sa的抑菌率達(dá)到100%。甘氨酸濃度為0.5%、1.0%時(shí),對Sa沒有抑菌作用,此時(shí)Sa以甘氨酸為營養(yǎng)物質(zhì);濃度為1.5%時(shí),甘氨酸開始對Sa產(chǎn)生抑制作用,當(dāng)濃度到2.5%時(shí),抑菌率為100.0%,抑菌效果最佳,濃度升高到3.0%,抑菌率同樣為100.0%,說明當(dāng)濃度到達(dá)2.5%時(shí),甘氨酸對Sa有很好的抑制作用。

    圖2 pH為7甘氨酸對Sa的抑制作用

    甘氨酸可作為微生物的良好氮源,對E.coli和Sa是營養(yǎng)物質(zhì),因此甘氨酸濃度過低則無法很好地抑制E.coli和Sa的生長,濃度過高則成本增加,并且對于氨基酸含量豐富的食品,添加的甘氨酸過量還可能會(huì)導(dǎo)致人體對營養(yǎng)吸收不平衡,因此甘氨酸對E.coli的最佳抑制濃度應(yīng)選擇2.0%,對Sa的最佳抑制濃度應(yīng)選擇2.5%。

    2 2 不同pH值甘氨酸的抑菌效果

    設(shè)置濃度為2.0%,pH值分別為5、6、7、8和9的甘氨酸溶液,測定其對E.coli的抑制作用效果,抑菌率分別為95.2%、98.1%、100.0%、100.0%、96.7%,如圖3所示。由圖3可知甘氨酸在pH 5~9范圍內(nèi)對E.coli都有良好的抑菌效果,且抑菌率差異不明顯,表明甘氨酸在pH 5~9的范圍內(nèi)都有抑菌作用。

    圖3 2.0%甘氨酸對E.coli的抑制作用

    設(shè)置濃度為2.5%,pH值分別為5、6、7、8和9的甘氨酸溶液,測定其對Sa的抑制作用效果,抑菌率分別為100.0%、92.4%、98.1%、97.0%、86.9%,如圖4所示。由圖4可知,甘氨酸在pH 5~9的范圍內(nèi)對Sa都有較好的抑菌效果,除pH=9的甘氨酸外,其他甘氨酸抑菌均抑菌率超過90.0%,且差異不明顯,表明甘氨酸在pH 5~8的范圍內(nèi)對Sa有良好抑菌作用,pH=9的甘氨酸抑菌效果稍差。

    圖4 2.5%甘氨酸對Sa的抑制作用

    甘氨酸在pH值為5~9的范圍內(nèi)對E.coli的抑制率均達(dá)到95.0%以上,對Sa的抑制率均達(dá)到85.0%以上,表明甘氨酸在較寬的pH值范圍內(nèi)對E.coli和Sa有廣泛的抑制作用。由圖3可知,甘氨酸在pH值為7或8時(shí),對E.coli的抑菌效果最佳,由圖4可知甘氨酸在pH為7時(shí)抑菌率為98.1%,pH值為8時(shí)為97.0%,pH為7比pH為8抑菌更好,綜合考慮,甘氨酸對E.coli的最佳抑菌的pH應(yīng)為7。由圖4可知甘氨酸的pH值為5時(shí)對Sa的抑菌效果最佳,因此甘氨酸對Sa的最佳抑菌pH為5。

    2.3不同時(shí)間甘氨酸的抑菌效果

    選擇甘氨酸濃度為2.0%,pH值為7,設(shè)置14、16、18、20 h和22 h 5個(gè)不同的培養(yǎng)時(shí)間,測定甘氨酸對E.coli的抑制效果,得到的抑菌率分別為100.0%、95.4%、100.0%、100.0%、98.3%,如圖5所示。由圖5可知,甘氨酸對E.coli的抑制作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,甘氨酸對E.coli的抑菌率沒有明顯變化,即甘氨酸在5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間里對E.coli都有良好的抑制效果,且5個(gè)時(shí)間里的抑菌率差異不明顯,表明甘氨酸在14~22 h內(nèi)對E.coli有良好的抑菌效果。

    圖5 濃度為2.0%,pH值為7的甘氨酸對E.coli的抑制作用

    選擇濃度為2.5%,pH值為5的甘氨酸,設(shè)置14、16、18、20 h和22 h 5個(gè)不同的培養(yǎng)時(shí)間,測定甘氨酸對Sa的抑制效果,得到的抑菌率分別為100.0%、100.0%、96.4%、91.1%、92.0%,如圖6所示。由圖6可知,甘氨酸對Sa的抑制作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸減弱,當(dāng)時(shí)間到16 h時(shí),抑菌率為100.0%,16 h后抑菌率降低,說明培養(yǎng)時(shí)間在16 h內(nèi)甘氨酸對Sa的抑制效果很好。甘氨酸在設(shè)置的5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間里對Sa都有良好的抑制效果,并且五個(gè)時(shí)間里的抑菌率差異不明顯,表明甘氨酸在14~16 h內(nèi)對Sa有良好的抑菌效果。

    圖6 濃度為2.5%,pH值為5的甘氨酸對Sa的抑制作用

    甘氨酸在較長的時(shí)間內(nèi)對E.coli和Sa的抑制作用達(dá)到90.0%以上,呈現(xiàn)出較好的抑菌效果,表明甘氨酸能在較長的時(shí)間范圍內(nèi)起到良好的抑菌作用。

    3 結(jié)論

    通過測定不同濃度、pH值和時(shí)間的甘氨酸對E.coli和Sa這兩種細(xì)菌的抑菌率,確定甘氨酸濃度為2.0%,pH為7,培養(yǎng)14~22 h時(shí),對E.coli的抑制作用最佳;甘氨酸濃度為2.5%,pH值為5,培養(yǎng)時(shí)間在16 h內(nèi)對Sa的抑制最佳。甘氨酸對E.coli和Sa都有較好的抑制作用。

    對比不同濃度甘氨酸對E.coli和Sa的抑制作用,較低的甘氨酸濃度即可抑制E.coli的生長繁殖,說明E.coli對甘氨酸更為敏感。對比甘氨酸在pH值在5~9的范圍內(nèi)對E.coli和Sa的抑制作用,pH的變化對E.coli和Sa的抑制效果影響不大。對比培養(yǎng)時(shí)間對E.coli和Sa的抑制作用,在22h內(nèi)甘氨酸對E.coli的抑制效果變化較小,在16 h后對Sa的抑制作用隨著時(shí)間的延長而減弱,說明甘氨酸對E.coli的抑制時(shí)間更為長久。

    4 結(jié)語

    大腸桿菌為革蘭氏陰性菌,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,甘氨酸對這兩種細(xì)菌都有良好的抑制作用,并在較寬的pH值范圍和時(shí)間范圍內(nèi)其抑菌率沒有顯著差異。

    甘氨酸可作為一種安全無害的防腐劑應(yīng)用于易被E.coli和Sa污染的食品中,如米粉,糕點(diǎn)。甘氨酸既具有防腐作用,又具有營養(yǎng)和改善食品風(fēng)味等作用,其研究和開發(fā)利用有著廣闊的前景。

    [1]宋彥梅,尹秋響,王靜康.甘氨酸的應(yīng)用及生產(chǎn)技術(shù)[J].氨基酸和生物資源,2003(2):55-60.

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    中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室子課題(編號(hào):J16093)。

    廖夏云(1985-),女,博士。研究方向:食品質(zhì)量與安全。

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