過表達eNOS的MSCs移植抑制肺動脈高壓大鼠NF-κB表達

趙科研，郭曉東，李紅巖，佟昌慈，張玉彪，王輝山，侯明曉*

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 1.心血管外科；2.急診醫(yī)學部，遼寧 沈陽110840)

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*通訊作者

過表達eNOS的MSCs移植抑制肺動脈高壓大鼠NF-κB表達

趙科研1，郭曉東1，李紅巖1，佟昌慈2，張玉彪2，王輝山1，侯明曉2*

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 1.心血管外科；2.急診醫(yī)學部，遼寧 沈陽110840)

目的 研究過表達eNOS的骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)移植對肺動脈高壓(PAH)大鼠的NF-κB影響。方法 構建過表達eNOS基因骨髓間充質(zhì)干細胞；成年雄性Sprague Dawley大鼠，建立分流性PAH模型36只，每組12只， Shunt組；MSCs組；MSCs+eNOS 組，正常大鼠為Control 組。由中心靜脈注入細胞，2周后進行測定血流動力學指標及肺組織病理變化，westernblot及熒光定量PCR測定肺組織表達NF-κB的變化。結(jié)果 MSCs移植能降低右心室收縮壓，減輕肺病理改變， MSCs+eNOS組下降更明顯。NF-κB的mRNA和蛋白表達在Shunt組表達最強，Control 組表達較弱，MSCs組、MSCs+eNOS 組較Shunt組明顯降低，且MSCs+eNOS 組更顯著。結(jié)論 MSCs和eNOS抑制高血流量PAH大鼠的NF-κB表達對高血流量的發(fā)揮治療作用。

NF-κB；內(nèi)皮型一氧化氮合成酶；分流性；動物模型； 肺動脈高壓

(ChinJLabDiagn,2016,20:1827)

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，存在于真核生物體內(nèi)，參與生物體內(nèi)很多重要的生理反應[1]，NF-κB在肺動脈高壓(PAH)的形成進程中扮演著重要的角色，在肺動脈血管重構中也發(fā)揮一定的生物學作用[2]。干細胞移植治療的再生手段和基因治療等研究不斷應用于PAH的治療，以打斷PAH的惡性循環(huán)[3-5]，是研究的熱點。采用骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)轉(zhuǎn)染eNOS基因，移植肺動脈高壓大鼠，NF-κB如何變化，我們進行如下研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗對象 成年雄性Sprague Dawley (SD)大鼠48只，體重150-200 g，周齡6周。購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心。

1.1.2 主要藥品試劑與儀器 NOS-3(eNOS)抗體(Santa)，GAPDH(Santa)和NF-κB (Abcam)，RT-PCR試劑盒(大連寶生物Takara公司)，DNA 擴增儀(PT一200型)為美國PE公司產(chǎn)品，熒光定量PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司GeneAmp7300)。

1.2 方法

1.2.1 細胞準備 構建過表達eNOS(人類NOS3)慢病毒載體(上海吉凱公司)，含有GFP標記。慢病毒轉(zhuǎn)染eNOS到SD大鼠MSCs(Cyagen公司)，第三代MSCs以0.25%的含EDTA的胰酶消化，PBS沖洗，1 000個細胞/μL濃度以PBS懸浮，置于冰上直到進行移植。

1.2.2 實驗動物分組及細胞移植 采用左側(cè)頸總動脈與左頸外靜脈吻合分流[6]建立高血流肺動脈高壓模型，12周后再次麻醉，每組12只：Shunt組；MSCs組；MSCs+eNOS 組；同一批正常大鼠12只做為Control 組。通過游離的右側(cè)頸外靜脈進行移植：MSCs組：1×106MSCs；MSCs+eNOS 組：1×106轉(zhuǎn)染eNOS的MSCs ；Shunt組及Control 組：等容積PBS。縫合頸部切口，大鼠清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 系統(tǒng)血流動力學指標 右心微導管測右心室收縮壓(RVSP)，壓力波形經(jīng)BL-420E系統(tǒng)記錄并保存。

1.2.4 病理學檢查 取大鼠的肺組織，置于10%中性福爾馬林液中固定，經(jīng)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色，光鏡顯微鏡觀察肺組織。分離心臟組織，測定右心室/(左心室+室間隔)質(zhì)量比。

1.2.5 MSCs肺組織定位 細胞移植2周后，處死MSCs+eNOS 組大鼠時，取右上肺，在暗光下操作，采用OCT包埋，冰凍切片，采用多聚甲醛固定，DAPI 50 mg/L復染，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察GFP表達。

1.2.6 western blot 檢測 提取肺組織蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉加入特異性一抗4°C雜交過夜，次日用1×TBST洗膜3次(10 min/次)，然后用1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫緩慢搖晃雜交2 h。l×TBST洗膜3次(10 min/次)。ECL(Bio-rad)發(fā)光，Western Blot成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.7 熒光定量PCR 設計eNOS上游引物：5′- AGT GGC TGG TAC ATG AGC AC -3′，下游引物5′-GGT GAC TTT GGC TAG CTG GT-3′ ；NF-κB上游引物5′-CGG CCA TGG ACG AAC TGT TC-3′，下游引物5 ′-GAA CAG TTC GTC CAC ATG GCC CAC TTC -3′；GAPDH上游引物：5 ′- ACG GCA AGT TCA ACG GCA CAG -3′，下游引物：5′- GAC GCC AGT AGA CTC CAC GAC A -3′。提取總RNA，采用目的基因和內(nèi)參基因進行熒光定量PCR反應，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應，熒光定PCR法檢測上述基因mRNA表達。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的eNOS表達

細胞均呈長梭形生長，極性較好，生長速度較快，轉(zhuǎn)染攜帶慢病毒后，可見細胞呈細胞漿綠色表達。移植2周后，肺臟中可見明顯綠色熒光表達。

2.2 移植后病理變化

細胞移植2周后MSCs組RVSP明顯下降，且轉(zhuǎn)染eNOS的MSCs能進一步降低RVSP。Shunt組肺小動脈中膜增厚、管腔狹窄，炎癥細胞增多，而MSCs組和MSCs+eNOS 組肺小動脈中膜增厚程度明顯減輕。 心室體重比及右心室肥厚指數(shù)在MSCs組和MSCs+eNOS 組較分流組明顯下降，轉(zhuǎn)染eNOS基因未進一步減輕雙心室的肥大。

2.3 NF-κB通路表達變化

熒光定量RT-PCR 和Westernblot 分析結(jié)果顯示，細胞移植2周后，NF-κB的mRNA和蛋白表達在Shunt組表達最強，Control 組表達較弱，MSCs組、MSCs+eNOS 組較Shunt組明顯降低，且MSCs+eNOS 組更顯著(P<0.05)(圖1)。

圖1 細胞移植后NF-κB mRNA和蛋白表達變化

3 討論

NF-κB最初由Sen等[1]在B淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)，對體內(nèi)的絕大多數(shù)細胞因子的產(chǎn)生、活化起調(diào)控作用，進而影響細胞功能，是凋亡、炎癥及免疫反應等過程中的重要調(diào)節(jié)因子[7]。NF-κB參與生物體內(nèi)很多重要的生理反應，該信號通路促進平滑肌細胞增殖、抑制調(diào)亡。

本實驗發(fā)現(xiàn)，MSCs移植及聯(lián)合eNOS移植均能夠降低RVSP，改善肺組織小動脈內(nèi)膜及中層厚度，增殖減緩，抑制了肺動脈高壓的進展，具有明顯的肺組織重構作用。結(jié)果顯示NF-κB mRNA和蛋白表達水平在分流組明顯最高，正常對照組低，實驗組MSCs移植則明顯降低，轉(zhuǎn)染eNOS移植則進一步降低，說明移植后通過抑制NF-κB通路激活，參與體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制細胞的增殖，MSCs及eNOS通過調(diào)控NF-κB表達發(fā)揮作用。

[1]Sen R,Baltimore D.Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein NF-kappaB by a posttranslational mechanism[J].Cell,1986,47(6):921.

[2]Hosokawa S,Haraguchi G,Sasaki A,et al.Pathophysiological roles of nuclear factor kappaB (NF-kB) in pulmonary arterial hypertension:effects of synthetic selective NF-kB inhibitor IMD-0354[J].Cardiovasc Res,2013 ,99(1):35.

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[4]Zhao Q,Liu Z,Wang Z,et al.Effect of Prepro-Calcitonin Gene-Related Peptide-Expressing Endothelial Progenitor Cells on Pulmonary Hypertension[J].Ann Thorac Surg,2007,84(2):544.

[5]Liu R,Wu S,Cao G,et al.Transfection of human hepatocyte growth factor gene inhibits advancing pulmonary arterial hypertension induced by shunt flow in a rabbit model[J].Transplant Proc,2013,45(2):705.

[6]ZHAO Ke-yan,WANG Hui-shan,SHANG Chang-qing,et al.Establishment model of new pattern and arteriovenous shunt of pulmonary artery hypertension in rats[J].Chin J Lab Diagn,2014,18(10):1586.

[7]Siebenlist U,Brown K,Claudio E.Control of lymphocyte development by nuclear factor-kappaB[J].Nat Rev Immunol,2005,5 (6):435.

Implantation of mesenchymal stem cells over-expressing eNOS prevents expression of NF-κB in rats with pulmonary arterial hypertension

ZHAOKe-yan,GUOXiao-dong,LIHong-yan，etal.

(DepartmentofCardiacSurgery,ShenyangNorthernHospital,Shenyang110840,China)

Objective To observe effects of mesenchymal stem cells (MSCs)over-expressing eNOS on NF-κB in rats with pulmonary artery hypertension (PAH).Methods MSCs were transfected by lentivirus expressing eNOS gene.Adult male Sprague Dawley rats were made as shunted PAH models,then were randomly divided into three groups:group shunt,group MSCs and goup MSCs+eNOS(n=12,respectively).The control group was matched normal rat.MSCs were injected through central vein.Two weeks later,hemodynamic index and lung biopsy were determined.Fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR)and Westernblot were used to determine the level of NF-κB.Results MSCs can reduce right ventricular systolic pressure and attenuated lung’s lesions.And it was more obviously in group MSCs+eNOS.The level of mRNA and protein of NF-κB was highest in group shunt,lower in group MSCs but lowest in group MSCs+eNOS.Conclusion MSCs and eNOS act on rats with high flow PAH by preventing the expression of NF-κB.

NF-κB;eNOS;shunt;animal model;pulmonary artery hypertension

1007-4287(2016)11-1827-03

R543.2

A

2016-03-18)